Оценка жизнеспособности пивоваренных дрожжей методом подсчета дрожжевых клеток. Дрожжи количество клеток
Количество - дрожжевая клетка - Большая Энциклопедия Нефти и Газа, статья, страница 2
Количество - дрожжевая клетка
Cтраница 2
Скорость потока сусла обусловливается производительностью завода и количеством дрожжей в трех первых чанах: количество дрожжевых клеток не должно быть меньше 100 млн / мл. [16]
Для определения количества дрожжевых клеток, имеющих форму шариков или палочек, в 1 г дрожжевой массы, полученной фильтрованием дрожжевой суспензии под вакуумом, предназначен метод, основанный на подсчете в камере Тома количества дрожжевых клеток в дрожжевой суспензии известной концентрации. Количество дрожжевых клеток в 1 г прессованных дрожжей зависит от их размеров, которые определяются расой дрожжей и условиями проведения процесса брожения ( в цехе. Для разных рас дрожжей, используемых на заводах, оно колеблется в больших пределах. [17]
В производственных дрожжах ( отбродившем дрожжевом сусле, содержание СВ в котором снизилось до 1 / 3 от первоначального) определяются видимая плотность бражки ( по показаниям сахарометра), кислотность и рН, а также количество дрожжевых клеток в 1 мл путем их подсчета под микроскопом в камере Горяева. [18]
При средней бродильной активности дрожжей эффективность единицы их биомассы в головном аппарате ( 7 0 16 - - 0 24) в два раза выше, чем в пятом ( q 0 076 - 0 84), хотя количество дрожжевых клеток возрастает в обратном направлении от первого до пятого аппарата. Следовательно, эффективность действия единицы биомассы дрожжей в концевых аппаратах батареи резко снижается продуктами метаболизма и недостатком питательного субстрата. Поэтому число дрожжевых клеток целесообразно увеличивать только в головном аппарате. [19]
Для определения количества дрожжевых клеток, имеющих форму шариков или палочек, в 1 г дрожжевой массы, полученной фильтрованием дрожжевой суспензии под вакуумом, предназначен метод, основанный на подсчете в камере Тома количества дрожжевых клеток в дрожжевой суспензии известной концентрации. Количество дрожжевых клеток в 1 г прессованных дрожжей зависит от их размеров, которые определяются расой дрожжей и условиями проведения процесса брожения ( в цехе. Для разных рас дрожжей, используемых на заводах, оно колеблется в больших пределах. [20]
Размножение дрожжей продолжается 18 - 24 часа, в зависимости от объема матки и начальной температуры. Количество дрожжевых клеток увеличивается при этом в 5 - 6 раз и к концу брожения достигает 120 - 160 млн. в 1 мл сусла. Одновременно с размножением дрожжевых клеток происходит сбраживание сахара, благодаря чему плотность среды уменьшается. Дрожжи, в которых в основном закончилось почкование и от-брод составляет А от первоначальной концентрации, принято называть зрелыми дрожжами. Так как концентрация дрожжевого сусла должна быть в пределах 19 - 21 %, то нормально отбродившие дрожжи должны иметь отброд 4 7 - 5 5 % - Если отброд выше 6 - 7 %, то причинами этого могут быть: неправильное приготовление осахаренной массы, плохой солод, недоброкачественное сырье и вырождение дрожжей. В последнем случае дрожжевую матку нужно очистить серной кислотой или же размножить дрожжи из чистой культуры. Из зрелых дрожжей отбирают 10 - 12 % матки, а основную массу их передают в бродильное отделение. [21]
Для оценки качества дрожжей, находящихся в бродильной батарее, и для оценки концентрации дрожжей, имеющих шарообразную, эллипсовидную или палочковидную форму, предназначен метод, основанный на определении физиологического состояния дрожжей по относительному содержанию молодых, зрелых, перезрелых, почкующихся, голодающих и мертвых клеток. Количество различных дрожжевых клеток подсчитывают под микроскопом с помощью камеры Тома. [22]
Наблюдения за температурой и рН ведут каждый час, одновременно следят за размножением и состоянием дрожжевых клеток под микроскопом. Когда количество дрожжевых клеток достигнет 250 - 300 млн / мл, в том числе почкующихся 20 - 25 % ( количество мертвых клеток с учетом остаточных спиртовых не должно превышать 5 - 7 %), засевные дрожжи из малого АЧК передаются в большой общим объемом 5 м3, где осуществляется четвертая стадия выращивания дрожжей. [23]
При периодическом культивировании дрожжей засевная кул тура содержит 100 - 120 млн. клеток в 1 мл. После смешивания i с суслом в дрожжанке количество дрожжевых клеток падает; 10 - 12 млн. / мл и за 16 - 18 ч вновь достигает первоначальной в личины. Такое резкое снижение концентрации дрожжей после зас ва сусла приводит к удлинению продолжительности процесса и н редко сопровождается инфицированием посторонней микрофлоро в чем и заключается основной недостаток данного способа. [24]
Поскольку в гидролизном и сульфитном сусле содержится недостаточное количество минеральных соединений азота и фосфора, его следует обогащать питательными солями - сульфатом аммония и суперфосфатом. Без добавления этих солей скорость сбраживания сахара снижается в 2 - 3 раза и увеличивается количество мертвых дрожжевых клеток. [25]
Счетную камеру помещают на предметный столик микроскопа. При этом увеличении в поле зрения микроскопа помещается не менее 16 малых квадратов, которые на рис. 51 обведены толстыми линиями. Количество дрожжевых клеток, находящихся в 16 квадратах, считают в четырех рядах по горизонтали в каждом квадрате. Дрожжевые клетки, которые пересекаются нижней и левой сторонами квадрата, подсчитывают в смежных квадратах. Для большей точности результатов анализа дрожжи подсчитывают в пяти местах препарата, анализируя четыре препарата. [27]
При дальнейших расчетах принято, что содержание дисперсной фазы в фугате настолько мало, что им можно пренебречь. Это допущение оправдано практикой эксплуатации сепараторов-сгустителей для дрожжевых суспензий. Количество дрожжевых клеток в фугате в поле зрения микроскопа составляет всего 3 - 6 шт. [28]
В течение всего процесса дрожжегенерирования массу непрерывно аэрируют. На стадии дрожжегенерирования обычно сбраживается около 30 % от Biero количества сахара, содержащегося в мелассе. Когда количество дрожжевых клеток в дрожжегенераторах достигает 90 - 110 млн. в 1 мл, начинают переток массы из дрожжегенераторов з первый ( головной) чан бродильной батареи. [29]
Страницы: 1 2 3
www.ngpedia.ru
| Дрожжи. Цель занятия изучить культуральные и морфологические признаки дрожжей; освоить методы микроскопической оценки дрожжей; подсчета микробных клеток дрожжей в счетной камере Горяева. Задания: 1) приготовить препараты «раздавленная капля» чистых культур различных физиологических рас дрожжей Saccharomyces cerevisiae и аспорогннных дрожжей; 2) изучить морфологию отдельных видов дрожжей; 3) определить содержание гликогена и метахроматина в дрожжевых клетках; 4) подсчитать количество нежизнеспособных дрожжевых клеток в исследуемой суспензии; 5) подсчитать количество дрожжевых клеток в исследуемой суспензии с помощью счетной камеры Горяева. Препараты «раздавленная капля» просматривают с объективом 8Х и 40Х. Оборудование и материалы: предметные и покровные стекла; камера Горяева, специальное отшлифованное покровное стекло, пипетки (микро пипетка и на 1 см3), раствор с массовой долей серной кислоты 5%, раствор метиленового синего по Леффлеру, раствор Люголя, кристаллизатор с водой, раствор фуксина или метиленового синего для простого окрашивания, метиленовый синий в разведении 1 : 40, бензин, набор красок, раствор йода, иммерсионное масло, бактериальные петли, пастеровские пипетки, микроскопы, бактериологические петли, препаровальные иглы, марлевые салфетки, суточные культуры дрожжей Candida, Torulopsis, Hausenula, Saccharomyces. Теоретические сведения. По современным представлениям в группу дрожжей объединяют одноклеточные микроскопические организмы, относящиеся к разным классам грибов, не образующие истинного мицелия, имеющие размеры в поперечнике 3-5 мкм, по длине – 10-15 мкм. Они встречаются среди различных классов высших грибов: аскомицетов, базидиомицетов и несовершенных грибов. Растут дрожжи на средах с кислым рН и образуют колонии мягкой консистенции, не врастающие в субстрат. Форма и цвет колоний различаются у разных видов дрожжей. Дрожжевые клетки могут иметь: округлую, овальную, яйцевидную, цилиндрическую, апикулятную или лимоновидную форму (рис. 33). Структура клеток (рис. 34) более сложная, чем у бактерий, включает оболочку, цитоплазму, дифференцированное ядро и другие фрагменты. Оболочка дрожжей легко просматривается в обычном световом микроскопе. Содержимое клеток дрожжей на ранней стадии роста однородно, затем в центральной части появляются многочисленные вакуоли и гранулы. Форма вакуолей изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста культуры: в молодых клетках дрожжей вакуоли обычно соответствуют форме клетки, в зрелых они несколько сдавлены, а в отмирающих клетках могут быть сморщены и сжаты в результате нарушения взаимодействия коллоидов внутри клетки. В клетках дрожжей накапливается большое количество запасных питательных веществ: гликоген (вещество типа крахмала), капельки жира, а в вакуолях—волютин (метахроматин), основным компонентом которого являются полифосфаты. Размножаются дрожжи вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты), так называемые «культурные» дрожжи; к делящимся – виды рода Shizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При почковании на поверхности клетки образуется один или несколько бугорков — почек, которые постепенно увеличиваются. Почки растут, пока не достигнут размеров материнской клетки, после чего происходит деление ядер. В почку из материнской клетки переходит часть протоплазмы и элементы ядра, после чего между двумя клетками образуется поперечная перегородка и почка отшнуровывается. Иногда почки, еще не отделившиеся, начинают почкование, образуя скопление дрожжевых клеток (рис. 35). При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. Спорообразование может наступить после многократного размножения путем почкования. Обычно спорообразование наблюдается при истощении питательной среды и хорошей аэрации. Если такие дрожжи выращивать в постоянно обновляемой среде или с частыми пересевами, то клетки их все время могут сохраняться в вегетативном состоянии и размножаться только почкованием. Но достаточно перенести такие дрожжи в среду, бедную питательными субстратами, как большинство клеток переходит к спорообразованию. В одной клетке образуется 2 - 4, а иногда 8 - 12 спор. Клетка при этом рассматривается как аск (сумка), а споры — как аскоспоры. К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты). Споры дрожжей имеют толстые оболочки и довольно устойчивы к неблагоприятным воздействиям, но в меньшей степени, чем эндоспоры бактерий (быстро погибают при температуре 60 °С). Таким образом, образование спор у дрожжей — это одновременно процесс размножения и формирования устойчивых форм. Некоторые виды дрожжей размножаются так же, как и бактерии, бинарным делением путем образования одной или нескольких поперечных перегородок. Такой способ размножения наблюдается, например, у представителей рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицетов). Дрожжам размножение делением несвойственно, поэтому данный род является исключением, отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, образуя споры что характерно для сумчатых грибов. Размножение делением свойственно также дрожжам рода Endomyces. Дрожжи способны разлагать различные сахара. Поэтому они встречаются там, где происходит выделение богатых сахаром соков: на фруктах, листьях, в нектаре цветов. В практической деятельности человека они издавна используются для получения хлеба, вина, пива, спирта, входят в состав кефирных грибков для производства кефира. В настоящее время в промышленности применяют различные виды дрожжей: наибольшее значение имеют культурные расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые обозначают римскими цифрами (XII, XI и т.д.) или заглавной буквой, соответствующей первой букве названия расы: М – минская, Я – Якубовского и т.д. Определенные физиологические расы Saccharomyces cerevisiae используют в соответствии с их биологической активностью в различных отраслях пищевой промышленности. Класс несовершенных грибов объединяет аспорогенные, (ложные) дрожжи, неспособные к половому размножению и образованию спор. К ним относятся представители рода Candida, Torulopsis, Cryptococcus, Rhodotorula, Pullularia и др. На твердых питательных средах такие организмы так же, как и сахаромицеты, образуют колонии различной консистенции. Несовершенные дрожжи имеют более характерную форму, отличающую их от других видов: стреловидную, треугольную, серповидную или колбовидную. Дрожжи родов Candida и Trichosporon наряду с круглыми и овальными клетками могут образовывать длинные клетки псевдомицелия. Они представляют собой довольно крупные одноклеточные организмы, в среднем 5 – 9 х 7 – 12 мкм, не образуют истинного мицелия, но могут вытягиваться в длину, соединяясь в цепочки. Такие образования называют псевдомицелием. Размножаются только почкованием, довольно широко распространены в природе. Они встречаются в различных водоемах, в почвах, на растениях, продуктах питания, в организме человека и животных. Некоторые виды Candida вызывают заболевание, называемое кандидозом, в биотехнологии используются для получения кормового белка при выращивании их на промышленных отходах (например, углеводородах), для получения некоторых аминокислот (Candida utilis для получения триптофана), витаминов (Candida guilliermondii для получения витамина В2 – рибофлавина). Широко распространенными являются также дрожжи рода Torulopsis, различные их виды используются в производстве сбраживаемых напитков типа кумыса, но вызывают болезни пива и некоторых других продуктов, получаемых путем брожения. Эти болезни проявляются в потере аромата, появлении неприятного запаха или ослизнения. Методические указания к выполнению работыМорфологические признаки дрожжей изучают просматривая препараты « раздавленная капля» с сухими объективами (8х, 40х) . Определение гликогена – полисахарид, животный крахмал содержится в клетке у эукариот и прокариот в виде включений (веществ, возникающих в результате метаболизма клетки). Служит в качестве запасного материала и при недостатке углеводов в питательной среде используется клеткой. Гликоген окрашивается йодом в бурый цвет. Для обнаружения гликогена используют крепкий раствор йода в йодистом калии (7 г йода + 20 г йодистого калия + 100 см3 воды). На предметное стекло наносят небольшую каплю раствора йода и размешивают в ней петлей такую же каплю жидкой культуры дрожжей. На препарат накладывают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой и через 2—3 мин микроскопируют. Наличие в цитоплазме бурых зернышек или крапинок указывает на присутствие гликогена. Перед обработкой раствором йода рекомендуется обезжиривать препарат путем фиксирования в смеси спирта с эфиром (1 : 2). Это делается для того, чтобы удалить из клетки жир, который тоже отчасти окрашивается йодом. При подогревании окрашенного йодом препарата до 60° С красно-бурая окраска гликогена исчезает, а после охлаждения восстанавливается. Иногда гликогену может быть примешана гранулеза, и при слабом растворе йода получается синее окрашивание, при крепком — красно-бурое. На препарате сахаромицетов много почкующихся клеток. Поскольку гликоген активно расходуется в процессе метаболизма, то его можно обнаружить только в материнских клетках. В зависимости от количества накопленного углевода их цвет может меняться от ярко-желтого до бурого. В растущих клетках (почках) гликоген как правило не обнаруживается. Обнаружение волютина (метахроматиновые зерна). Некоторые бактерии и дрожжи содержат в цитоплазме клетки вещество, состоящее из неорганических полифосфатов, запасное фосфор- и азотосодержащее вещество, производное нуклеиновой кислоты, получившее название волютин. В дрожжевой клетке при состоянии покоя волютин можно обнаружить в виде большой круглой капли внутри вакуоли. При состоянии активного обмена волютин в клетках располагается мелкими каплями по стенкам вакуоли или непосредственно под клеточной стенкой. В большом количестве волютин накапливается у дрожжей перед почкованием. Накопление волютина особенно интенсивно происходит при выращивании дрожжей на средах, богатых фосфатами. Для обнаружения волютина в дрожжах используют расу XII дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на твердой питательной среде. Метод окраски основан на плохой растворимости волютина в растворах кислот. На предметное стекло наносят каплю воды, петлей в форме замкнутого кольца вносят в неё культуру дрожжей, распределяют равномерно и круговыми движениями делают тонкий мазок на площади 1 – 2 см2. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и окрашивают метиленовым синим по Лёфлеру (1,5 – 2 мин), после чего смывают краситель водой и обрабатывают препарат раствором серной кислоты с массовой долей 5 % в течение 5 – 7 сек. Кислоту смывают водой, препарат высушивают и просматривают с иммерсионным объективом. Цитоплазма дрожжевых клеток при этом окрашивается в голубой цвет, а гранулы полифосфатов – в синий. Можно окрашивать фиксированные препараты 20-30 с карболовым фуксином Циля. Через 0,5-1,0 мин промыть препарат водой, обесцветить 20-30 с раствором Н2SO4 с массовой долей 1%, промыть, дополнительно окрасить 20-30 с метиленовым синим (1 : 40), промыть, промокнуть, просмотреть с иммерсионной системой. Гранулы волютина приобретают красный цвет, цитоплазма – синий. Определение процентного содержания нежизнеспособных клеток. На предметном стекле смешивают каплю суспензии дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII, выращенной на неохмеленном пивном сусле, смешивают с каплей метиленового синего. В препарате просматривают 10 полей зрения. Мертвые клетки окрашены в нем в синий цвет, живые остаются бесцветными. Определяют процентное содержание нежизнеспособных клеток по отношению к общему числу клеток, наблюдаемых в поле зрения. Активные культуры дрожжей, используемые для засева, содержат не более 5 % мертвых клеток. Определение способности дрожжей к размножению. Количество почкующихся клеток характеризует способность дрожжей к размножению: активные дрожжи содержат 40—70 % клеток с почками. Из дрожжевой суспензии готовят препарат «раздавленная капля» и определяют процентное содержание почкующихся клеток по отношению к суммарному количеству дрожжей с почками и без них. Подсчет количества клеток в счетной камере. Для подсчета клеток крупных бактерий, дрожжей, конидий плесневых грибов применяют различные счетные камеры, из которых наиболее часто используют камеру Горяева (рис. 39). Она представляет собой толстое предметное стекло, разделенное глубокими бороздками на поперечные площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена пополам. На каждой ее части нанесена сетка. Боковые площадки расположены на 0,1 мм выше центральной (глубина камеры) и служат для притирания покровного стекла. Сетка камеры Горяева разделена на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 квадратов в ряду). Площадь большого квадрата равна 1/25 мм2 и разделена на 16 малых квадратов. Сторона малого квадрата равна 1/20 мм, площадь – 1/400 мм2. Часть больших квадратов разграфлена вертикально, горизонтально или не разграфлена. Камеру и специальное шлифованное покровное стекло хорошо промывают и просушивают. На поверхность сеток наносят небольшую каплю исследуемой суспензии, накрывают шлифованным стеклом и притирают покровное стекло к боковым площадкам. Жидкость под покровным стеклом должна растекаться по всей сетке равномерно, без пузырьков. Для того чтобы объем жидкости точно соответствовал расчетному объему камеры, покровное стекло притирают к боковым площадкам камеры до появления цветных колец (можно вначале притереть стекло, а потом из пипетки осторожно заполнить камеру). Подсчет клеток рекомендуется производить через 3—5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и расположились в одной плоскости. Подвижные формы микроорганизмов перед нанесением на сетку следует убить нагреванием или добавлением 0,5 % формалина. Камеру помещают на предметный столик микроскопа и рассматривают с объективом 8Х или 40X (в зависимости от размеров клеток изучаемого объекта). Для получения достоверных результатов подсчет следует проводить в 5 больших или 20 малых квадратах по диагонали или по углам сетки и в центре в трех препаратах. Учитывают все клетки, находящиеся внутри квадрата и на пограничных линиях, если они больше чем наполовину лежат внутри квадрата. Клетки, пересеченные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех сторон квадрата; клетки, расположенные вне квадрата, не учитывают. Количество клеток в 1 мл исходной суспензии: , где С – число клеток в 1 мл суспензии; а – среднее число клеток в квадрате сетки; h – глубина камеры, мм; S – площадь квадрата сетки, мм2; n – степень разведения исходной суспензии; 1000 мм3 = 1 мл. Контрольные вопросы.
|
dereksiz.org
Оценка жизнеспособности пивоваренных дрожжей методом подсчета дрожжевых клеток
22.07.2018
Норма засева дрожжами, как вы, наверное, слышали, очень важна для создания желаемого вкусового профиля пива. При засеве излишнего количества дрожжей пиво приобретает пресный, безжизненный вкус, в то время как недозасев приводит к выраженному вкусу алкоголя и возможному останову брожения. Обычно, если засевать дрожжи в пределах двукратной величины целевой нормы, то полученное пиво будет иметь целевые параметры.
Чтобы подсчитать соотношение живых и мертвых дрожжевых клеток с помощью гемоцитометра, вам понадобятся:
Микроскоп с 400-кратным усилением
Гемоцитометр
2 пробирки либо маленьких пузырька
Мерная пипетка объемом 2 мл
Сосуд с плотной крышкой объемом 250 мл (1 чашка) или более
Метиленовая синь (можно приобрести в зоомагазине)
Шаг 1, приготовление 0,01% исходного раствора метиленовой сини.
Не беспокойтесь, эта процедура выполняется только один раз. Чтобы отличить живые клетки от мертвых используется их окрашивание. Метиленовая синь имеет способность присоединяться к молекулам кислот, таких, как, например, содержащаяся в клетках дрожжей дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). При этом живые клетки дрожжей способны разлагать метиленовую синь, проникшую через клеточную мембрану. В результате мертвые клетки окрасятся в синий цвет, а живые не окрасятся. Поскольку метиленовая синь токсична для клеток, ее концентрация должна быть ниже 0,1%, и после того, как дрожжевые клетки были окрашены, они должны быть подсчитаны в течение получаса. При работе с метиленовой синью помните, что, так как это очень насыщенная краска, то и пятна от нее очень стойкие. Если вы прольете всего лишь каплю на кухонный стол, то есть риск, что синее пятно останется навсегда. Метиленовая синь, продаваемая для очистки аквариумов, обычно имеет концентрацию 2,303%.
Для разбавления этого раствора до концентрации в 0,01% , которая рекомендуется лабораторией White Labs:
1) Налейте 1 мл метиленовой сини концентрации 2,303% в сосуд емкостью 250 мл.
2) Залейте в сосуд 230 мл воды (230 грамм, 7,77 жидких унций, 47 чайных ложек, или одна чашка без 1 чайной ложки)
Для подсчета вам понадобится всего 0,5 мл, поэтому приготовленный раствор послужит для тестов в течении еще нескольких лет.
Шаг 2, готовим образец.
При помощи гемоцитометра вы будете исследовать только очень малую часть взвеси дрожжей, поэтому очень важно, чтобы при заборе образца взвесь была как можно более однородна. Каждый раз следует 3 раза набирать взвесь в пипетку и выпускать ее, та как на стенках пипетки остается примерно 5% от предыдущего образца. Набор взвеси в пипетку три раза гарантирует, что образец не будет разбавлен остатками предыдущего образца или воды, которой промывалась пипетка.
1) Встряхивайте сосуд с взвесью дрожжей до тех пор, пока взвесь не станет равномерно перемешанной. (Если взвесь не слишком густая, можно качественно перемешать ее при помощи специальной пластины для смешивания.)
2) Встряхивайте сосуд еще некоторое время.
3) Используя пипетку, отделите 1 мл взвеси дрожжей из сосуда. Если взвесь содержит крупные частицы, пипетка может засориться. В таком случае для отбора образца можно использовать трубочку для коктейлей.
4) Поместите 1 мл образца в одну из пробирок. Чем точнее будет выдержан объём взятого образца, тем точнее будут результаты.
5) Добавьте 19 мл воды в образец для разбавления его в отношении 20:1
6) Смещайте образец, энергично тряся пробирку, либо наберите и вылейте раствор назад с помощью пипетки около 10 раз. Набирание и выливание взвеси дрожжей через небольшое отверстие пипетки поможет раздробить большинство комочков, содержащихся в взвеси.
7) Перелейте при помощи пипетки из пробирки с образцом 0,5 мл взвеси во вторую пробирку.
8) Простерилизуйте пипетку
9) С помощью пипетки добавьте 0,5 мл 0,01% раствора метиленовой сини во вторую пробирку. Обратите внимание на то, что образец при этом дополнительно разбавляется в пропорции 2:1
Шаг 3, помещение образца в гемоцитометр.
1) Поместите гемоцитометр на бумажное полотенце и установите на место покровное стекло.
2) Перемешайте окрашенную взвесь дрожжей, набирая и выпуская ее из пипетки по крайней мере три раза.
3) Наберите в пипетку небольшое количество взвеси дрожжей (вам понадобится всего лишь 0,1 мл, меньше капли).
4) Поднесите пипетку к гемоцитометру, не касаясь его кончиком пипетки.
5) Выдавите висящую каплю и коснитесь ею точки внесения образца на гемоцитометре. Счетная камера должна заполниться до такой степени, что жидкость начнет переливаться в центральную зону перелива. Если часть жидкости начинает переливаться в боковые канавки, то это нормально, главное, чтобы они не заполнились. Если центральная зона не будет содержать в себе образца, результат окажется заниженным. Если боковые канавки будут заполнены, то результат будет завышенным.
Шаг 4, подсчет клеток.
Если у вас нет опыта использования микроскопа, то вам потребуется некоторое время для изучения ручек настройки и инструкции по правильной настройке микроскопа. Количество регулировок, имеющихся на современном микроскопе, меня лично просто удивляет, удивляет также то, насколько четким может быть изображение, если все настроено правильно. Нужно принимать во внимание гораздо больше вещей, чем одна только ручка настройки фокусировки. Когда вы рассматриваете клетки, вам необходимо отметить, как много клеток сгруппированы. Наличие кластеров, или групп клеток, указывает на то, что раствор не был перемешан должным образом, и ваш подсчет не будет репрезентативным для всей дрожжевой смеси. Сфокусируйтесь на клетках и при этом максимально закройте диафрагму. Если фокусировка слишком резкая, вокруг клеток будет виден ореол. Если фокусировка слишком слабая, то клетки будут выглядеть размытыми. Как только клетки окажутся в фокусе, открывайте диафрагму до тех пор, пока синие клетки все еще будут окрашены в синий цвет, а у неокрашенных клеток будет видна клеточная мембрана. Если диафрагма открыта слишком сильно, клетки будут выглядеть бледными, и при подсчете вы можете потерять часть из них. Фокус очень важен. Слишком резкий фокус может привести к тому, что из-за ореола мёртвые клетки будут выглядеть как живые.
1) Определите местоположение верхней левой счетной камеры (так называемый квадрат №1)
2) Подсчитайте и запишите количество живых (неокрашенных) и мертвых (синих) клеток.
3) Повторите процедуру для верхней правой, средней, нижней левой и нижней правой камер.
4) Если вы хотите оценить точность полученных данных, то можно обработать полученные данные для этих пяти квадратов методами статистического анализа.
Шаг 5, расчет.
1) жизнеспособность – процентное содержание живых клеток
v – общее число живых клеток во всех пяти квадратах.
d – общее количество мертвых клеток во всех пяти квадратах.
Жизнеспособность = v/(v+d)
Например: для v = 432 и d = 10 жизнеспособность = 432 / (432+10) = 98%
2) плотность жизнеспособных клеток – количество живых клеток на единицу объема
df = коэффициент разбавления = 20
sf = коэффициент окрашивания = 2
vol = объем квадратов, в которых ведется подсчет = 4 нл х 5 квадратов = 20 нл
cd = плотность жизнеспособных клеток в миллиардах на литр
cd = v * df * sf / vol = v * 20 * 2 / 20cd = v * 2
например: 432 * 2 = 864 миллиарда клеток на литр
3) объем дрожжей для засева – это количество дрожжевой взвеси, нужное для достижения требуемой нормы засеваpv = объем дрожжей для засева в млc = количество клеток для засева в миллиардахpv = c / cd * 1000 пример: c = 200 миллиардов (количество клеток, необходимых для засева)cd = 864 миллиарда клеток на литрpv = 200 / 864 * 1000 = 231 мл (или около 231 грамм)
По этой теме имеется изобилие доступной информации, вот несколько самых подходящих источников, которые мне встретились:
Замечательный учебник с картинками, на которых изображено то, что вы должны видеть при подсчете: http://www.whitelabs.com/beer/CellCounting&Viability.pdf
(1) Пошаговая инструкция от лаборатории White Labs:http://www.whitelabs.com/beer/cell_count.html
Еще несколько прекрасных поясняющих фотографий, в том числе с изображениями некоторых вредных бактерий: http://www.whitelabs.com/beer/microscope.html
(2) В настоящее время я использую 0,03% раствор метиленовой сини, поскольку он вызываете лучшее окрашивание.
Метиленовая синь (слева), пробирки (справа), слева направо: спирт, образец дрожжевой взвеси, раствор взвеси в пропорции 20:1, окрашенный образец и вода.
Помещение образца в гемицитометр (слева), подсчет клеток (справа), живые клетки обведены зеленым. Мертвые клетки обведены красным. Синяя стрелка сверху указывает на брух. Синяя стрелка слева указывает на волокно, попавшее при очистке предметного стекла.
Внимание! Данная статья 18+ не рекламирует пиво или отдельно взятые пивные бренды, а носит информационно-энциклопедический характер. Чрезмерное употребление пива вредит вашему здоровью.© Полное или частичное копирование материалов без согласования с владельцами ресурса запрещено. - 2657246
old.beersfan.ru
 |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
 Пример видео 3 |  Пример видео 2 |  Пример видео 6 |  Пример видео 1 |  Пример видео 5 |  Пример видео 4 |
Администрация муниципального образования «Городское поселение – г.Осташков»