Исследование окрашенных препаратов. Окраска дрожжей по граму
Окраска по Граму
При обработке мазков (срезов) из органов и тканей, содержащих микроорганизмы, генцианвиолетом, а затем йодом, препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни из содержащихся в мазке бактерий также обесцвечиваются, а другие окрашиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, фуксином Пфейффера) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), не обесцвечивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. Лучше всего окраска по Граму получается после фиксации мазков физическим методом (нагреванием). Особенности отношения тех или иных видов бактерий к разным краскам, в частности, к окраске по методу Грама, характеризуют так называемые тинкториальные свойства микробов.
Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1—2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1—2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30—60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафранином, нейтральротом или везувином) в течение 2—3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.
Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера).
Нельзя пользоваться загрязненной фильтровальной бумагой: возможен механический перенос микробов с одного мазка на другой, что может отразиться на результатах микроскопии. Продолжительность воздействия краской, раствором Люголя (протравой) и спиртом зависит от толщины мазка. Особенно ответственным моментом в окраске по Граму является обесцвечивание мазка спиртом. При коротком воздействии спирта получаются перекрашенные препараты, а при длительном все микробы (в том числе и rpaмположительные) обесцветятся. На густой, толстый мазок (например, из агаровой культуры) время воздействия спиртом должно быть большим, нежели на тонкий мазок, особенно с жидких культур. При воздействии спиртом на неравномерно приготовленный мазок в толстых его частях микробы остался необесцвеченными, а в тонких обесцветятся; получится «пестрая» картина окраски, что может привести к неправильным выводам.
Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния. С другой стороны, в очень молодых культурах (несколько часов роста) из семейства энтеробактерий гигантские, юные формы этих бактерий, которые в 2—3 раза крупнее взрослых особей (18-часовых), очень базофильны вследствие перегрузки их цитоплазмы рибонуклеинатами. Поэтому при окраске по Граму они окрашиваются фуксином так интенсивно, что при плохом освещении их можно принять за грамположительные вегетативные формы спороносных палочек.
Для начинающих, а также в сомнительных случаях, рекомендуется на том же стекле, где находится исследуемый мазок, приготовить по сторонам контрольные препараты — один из культуры микробов, заведомо грамположительных, а другой — из грамотрицательных.
При обесцвечивании препарата в окраске по Граму спирт можно наливать непосредственно на мазок, постоянно покачивая стекло. Лучше же обесцвечивание проводить в кюветках, куда наливают спирт и, захватив пинцетом Корнэ препарат, поднимают и опускают его, следя за цветом стекающего со стекла спирта. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в кюветке; обычно для этого требуется 10—30 секунд, в зависимости от толщины мазка.
Спирт 96° в кюветках следует чаще сменять (80° спирт уже неправильно дифференцирует мазок). Отработанный спирт обычно сливают из кюветок в спиртовые горелки.
Для начинающих можно рекомендовать обесцвечивание мазков йодированным спиртом. Установлено, что если к обесцвечивающей жидкости добавить немного йодной настойки, то микробы, окрашивающиеся грамположительно, не обесцвечиваются в такой жидкости даже в течение часа, а грамотрицательные раскрашиваются приблизительно в 5 секунд. По данным Саватеева, достаточно добавить 2—4 мл 10% йодной настойки на 100 мл 95° спирта; раствор может сохраняться долгое время. В том случае, если вместо спирта используют ацетон, йодную настойку прибавляют перед использованием.
Для обесцвечивания мазков йодированным спиртом достаточно двух минут, после чего следует промывка водой и дополнительная окраска фуксином Пфейффера.
studfiles.net
3. Способы выявления оболочки бактерий.
ВОПРОСЫ ПО ПРАКТИЧЕСКИМ НАВЫКАМ
1.Сущность и техника окраски по Граму.
Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей — грамположительны и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, многие неспороносные бактерии — грамотрицательны и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма — розовый. На мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
2. Сущность и техника окраски по Циль-Нильсену. Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.
Методика окраски:
| 1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в пламени до появления паров. | Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава. |
| 2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают. | |
| 3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты. | Серная кислота-обесцвечивающий фактор. |
| 4. Промывают водой | |
| 5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут | Синька Леффлера — дополнительная краска |
| 6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией | Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора — синего цвета |
Методы определения строения клеточной стенки.
Окраска по Граму. При окрашивании клеток генцианвиолетом (кристаллфиолетовым) и последующем докрашивании раствором люголя (J в KJ), в КС образуется комлпекс пептидогликан+йод+генцианвиолет, который затем обесцвечивают спиртом. У грам отрицательных мо, т.к. у них слой ПГ тонкий весь окрашенный комплекс вымывается из клеточной стенки и они становятся бесцветными. У грам положительных комплекс остается связанным в толстом слое пептидогликана. В итоге после первого окрашивания – грам+ – синие, грам – прозрачные. 2 этап окраски по Граму – этап докрашивания фуксином. После второго этапа грам+ остаются синими, а грам- становятся красными.
КОН-тест. В основе метода лежит способность КС грамположительных микроорганизмов сохранять целостность при воздействии гидроокиси калия, тогда как КС грамотрицательных бактерий при этом разрушается. Постановка пробы с КОН предусматривает суспендирование петли суточной агаровой культуры в капле 3% раствора КОН на предметном стекле. При «+» реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмом, жидкость в капле становиться вязко, нити слизи тянутся за петлей на 0,5-2 см. образование слизистой консистенции связывают с выходом из клетки ДНК, являющейся вязким компонентом.
3.В брюшную полость экспериментального животного вводят микроорганизмы, исследуют в процессе фагоцитоза форму мембранной упаковки бактерий, выявляют внеклеточную одномембранную и внутриклеточные одно-, двух- и трехмембранные формы упаковки бактерий. Способ служит основой для разработки новых способов и методов лечебного воздействия на ряд хронических инфекционных заболеваний (туберкулез, лепра и т.д. ).
4. Сущность и техника окраски по Ожешко.
1. высушенный мазок наливают 0,5 % раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2 мин.
2.Препарат промывают водой и фиксируют над пламенем горелки.
3.Окрашивают по способу Циля-Нильсена.
Споры прочно удерживают карболовый фуксин и окрашиваются в красный цвет, цитоплазма бактерий обесцвечивается 5% серной кислотой и после докрашивания метиленовым синим приобретает синий цвет.
5. Сущность, техника обработки препаратов по Морозову.
Тонкий препарат, приготовленный из тканевой жидкости, подлежащей исследованию, высушивают в термостате при температуре 37 °С. На сухой препарат наливают 5—10 капель реактива I, через 1 мин реактив I сливают и препарат промывают дистиллированной водой. На препарат наслаивают реактив II и подогревают на пламени горелки до появления паров, затем тщательно промывают препарат водой и наносят реактив III так, чтобы он покрыл всю поверхность препарата. Предметное стекло вновь подогревают в течение 2— 3 мин до тех пор, пока окраска мазка не станет темнокоричневой. После тщательного промывания дистиллированной водой препарат высушивают и исследуют в микроскопе, пользуясь иммерсионной системой.
Данный метод окрашивания дает импрегнацию серебром бледных трепонем, которые становятся темнокоричневого или почти черного цвета.
studfiles.net
Окраска по Граму | Info-Farm.RU
Окраска по Граму (или метод Грама) — эмпирически выведенный метод различения бактерий с помощью окрашивания их определенным методом на две большие группы: Грамположительные и Грамотрицательные), различающихся химическими и физическими свойствами их клеточной стенки.
Этимология
Метод называется в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Христиана Грама (1853-1938), который разработал этот метод в 1884 году чтобы различить бактерии Pneumococcus и Klebsiella pneumoniae.
Использование
Окраска по Граму — одна из самых полезных красящих процедур в лабораторных исследованиях в микробиологии. Процедура широко используется как инструмент для различения Грамм-отрицательных и Грам-положительных бактерий, обычно являются первым шагом в определении идентичности специфического бактериального образца.
В медицине окрашивания по Граму выполняется при анализе крови или биопсии, когда подозревается инфекция. Этот метод гораздо быстрее, чем культура, и особенно важен, когда определение типа инфекции необходимо для прогноза и выбора метода лечения. Например, при диагностике цереброспинальной жидкости менингитом и жидкости суставов на септический артрит.
При анализе, например, Коки и спороносные формы бактерий, а также дрожжи — грам-положительные и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, большинство других бактерий — грамотрицательные и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток эукариот приобретают ярко красного цвета, а цитоплазма — розового.
Техника проведения окрашивания
Окраска по Граму относится к сложному способу окрашивания, когда на мазок влияют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обезбарвлюючи вещества: спирт, кислоты и др. Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметанового группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристалл виолет. Грам-положительные (грамм (+)) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительном окраске фуксином Грамм (+) микроорганизмы не меняют сначала присоединен фиолетовый цвет.
Грамотрицательные (грамм (-)) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом соединения, легко разрушается под действием спирта. В результате микробы обесцвечиваются и потом окрашиваются фуксином, приобретая красного цвета.
Подготовка материала для окраски
Материал исследуемого распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.
Фиксация
При фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла, и поэтому при дальнейшем окрашивании препарата клетки не смываются. Кроме того, убиты микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положена действие высокой температуры на клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
Физический способ фиксации Стекло с препаратом берут пинцетом и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют таким приемом: свободную от мазка поверхность стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильной фиксации стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущение ожога (70-80 ° С).
Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96% и наркозного эфира в соотношении 1: 1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96% — 60%, хлороформа 30%, ледяной уксусной кислоты 10 %). Стекло с высушенным мазком погружают в стакан с фиксирующей веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.
Процесс окрашивания
- На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2-3 минуты. Чтобы избежать осадка красят через фильтровальную бумагу.
- Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором, по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2: 1) в почернение препарата.
- Раствор сливают, мазок прополаскивают 96 ° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок НЕ обесцветится и жидкость стекает, не станет чистой (примерно 20-40-60 секунд).
- Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
- Для выявления грамотрицательных бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранина (2-5 мин).
- Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.
Изображения по теме
info-farm.ru
методы окраски
Методы окраски мазков
Простой метод. Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Сложные методы. Включают последовательное нанесение на препарат красителей, различающихся по химическому
составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.
Окраска по методу Грама.
1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снимают, а краситель сливают..
2. Наносят раствор Люголя на 1—2 мин.
3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30—60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1—2 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный.
Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в проницаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме. В клеточной стенке грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый (мукопептидный слой), содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту. Пептидогликаны грамположительных бактерий структурно отличаются от грамотрицательных бактерий. Тейхоевые кислоты стабилизируют ионы магния на поверхности клеток. У грамположительных бактерий на поверхности клетки имеется комплекс протеин — рибонуклеат магния; соотношение РНК и ДНК в их цитоплазме составляет 8 :1; у грамотрицательных бактерий это соотношение равно 1:1. Изоэлектрическая точка цитоплазмы у грамположительных бактерий находится при рН 2,0—3,0, у грамотрицательных — около 5,0. После обработки раствором йода, являющегося окислителем, происходит сдвиг изоэлектрической точки в кислую сторону, выраженный у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.
Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.
Окраска по Граму имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза и др., к грамотрицательным—гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий могут окрашиваться по Граму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, изменяющих структуру клеточной стенки.
Основная ошибка, допускаемая при окраске по Граму,состоит в переобесцвечивании или недообесцвечивании мазка спиртом. В первом случае грамположительные бактерии могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамот-рицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Во втором случае грамотрицательные бактерии могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания (см. п. 3 описания окраски по Граму).
■Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля— Нельсена.
1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3—5 мин.
2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.
3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1—2 мин для обесцвечивания.
4. Промывают водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3—5 мин.
6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют. Кислотоустойчивость обусловлена наличием в клеточной стенке и цитоплазме бактерий повышенного количества ли-пидов, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия красителя с бактериальными клетками, которые окрашиваются при этом в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окрашенными фуксином в красный цвет.
Окраска спор по методу Ожешки.
1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2—3 мин.
2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают препарат по Цилю — Нельсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий.
Окраска зерен волютина по методу Нейссера.
1. На фиксированный мазок наносят ацетат синьки Нейссера на 2—3 мин. 2. Наносят раствор Люголя на 10—30 с.
3. Промывают препарат водой.
4. Мазок докрашивают водным раствором везувина или хризоидина в течение 54—1 мин.
5. Промывают водой, высушивают и микроскопируют. Зерна волютина представляют собой соединения, имеющие
в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет.
Обнаружение капсул по методу Бурри—Гинса.
1. Готовят препарат по Бурри: смешивают каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифовальным краем готовят мазок так же, как мазки из крови; затем его высушивают и фиксируют.
2. На мазок наносят водный раствор фуксина на 1—2 мин.
3. Промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно-розовом фоне.
studfiles.net
Окраска по Граму
Окраска по Граму – основной метод окраски в бактериологии. С окраски по Граму начинается описание морфологических свойств. Такое значение этого метода обуславливается тем, что окраска бактериальной клетки по Граму зависит от типа строения её клеточной стенки и, соответственно, принадлежности к отделу Firmicutes или Gracilicutes – первого этапа идентификации любого вида в бактериологии. Окраска по Граму осуществляется в четыре этапа.А. На первом этапе фиксированный мазок окрашивается генциановым фиолетовым.
1. Окрашивание продолжается 1 – 2 минуты.2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии окрашиваются этой краской в синий цвет.Б. На втором этапе мазок обрабатывается раствором Люголя, который формирует с генцианвиолетом красящий комплекс, локализующийся на цитоплазматической мембране.1. Обработка раствором Люголя продолжается 1 – 2 минуты.2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии на этом этапе остаются синими.В. На третьем этапе мазок обесцвечивается спиртом.1. Обесцвечивание спиртом продолжается примерно 20 секунд с последующим обильным промыванием водой.2. Грамположительные бактерии за это время не успевают обесцветиться и остаются синими, а грамотрицательные, вследствие более тонкого слоя пептидогликана, препятствующего вымыванию спиртом красящего комплекса, обесцветиться успеют и, следовательно, станут бесцветными.Г. На четвертом этапе мазок окрашивается водным фуксином или другой красной краской – сафранином.1. Докраска красной краской продолжается 1 – 2 минуты. Причем, этот этап лучше продлить подоль-ше, так как после обесцвечивания бактериальная клеточная стенка воспринимает краску хуже, чем обычно.2. Грамположительные бактерии остаются синими, так как они уже окрашены более темной краской а грамотрицательные, которые на предыдущем этапе обесцветились, на этом этапе окрашиваются в красный цвет. Д. Грамположительные бактерии составляют меньшую часть тех бактерий, которые изучает меди-цинская микробиология. Ниже приводятся основные (этот перечень будет позже добавлен неспорооб-разующими анаэробами).1. Грамположительными являются большинство кокков (кроме нейссерий): стафилококки, стрепто-кокки и пневмококки, энтерококки.2. Среди палочек грамположительными являются листерии, бактерии актиномицетного ряда (актино-мицеты, микобактерии, коринебактерии), спорообразующие палочки (бациллы и клостридии).Е. Большинство бактерий, имеющих медицинское значение, грамотрицательные. Лишь по отношению к микоплазмам не корректно говорить об их грамотрицательности (хотя по Граму они окрашивались бы в розовый цвет – если бы их так окрашивали, так как на практике этот метод в изучении микоплазм не применяется). Дело в том, что грамоложительные и грамотрицательные бактерии отлича-ются друг от друга типом клеточной стенки (прежде всего – количеством содержащегося в ней пепти-догликана), а у микоплазм клеточной стенки с содержанием пептидогликана нет.1. Из кокков грамотрицательные – нейссерии.2. Грамотрицательными являются большинство палочек (собственно все, за исключением перечисленных выше грамположительных).3. Клеточную стенку грамотрицательного типа имеют также спирохеты.
worldofscience.ru
Исследование окрашенных препаратов
Окраска включений в бактериях.
Краска Нейссера:
а) метиленового синего 0,1 г, 95° спирта 2 мл, ледяной уксусной кислоты 5 мл, дистиллированной воды 100 мл;
б) раствор хризоидина, везувина или бисмар браун: красителя 1 г, дистиллированной воды 300 мл. Краситель растворяют в кипящей воде и фильтруют через бумагу.
Окраска по Нейссеру для выявления зернистости дифтерийных палочек.
В растворе метиленового синего держат 1 минуту, в растворе Люголя—1 минуту.
Промывают водой. Докрашивают раствором хризоидина (или везувина, или бисмарк-браун) 1—3 минуты. Промывают водой.
Тела бактерий окрашиваются в нежно-желтый цвет, зерна Бабеша — Эрнста—в темно-синий.
Окраска по Мейеру.
Одновременно из исследуемых бактерий готовят два одинаковых препарата и фиксируют жаром или 5—15 минут в жидкости Карнуа. Красят оба мазка 10 минут метиленовым синим Леффлера и затем один помещают в 1% водный раствор серной кислоты, другой - в 4% водный раствор поташа. Через 5 минут препараты сушат фильтровальной бумагой (не промывать!). Препарат, обработанный кислотой, докрашивают 0,2% раствором светлого зеленого (лихтгрюн) с 2-3 капля и крепкой уксусной кислоты или хризоидином. Бактерии окрашиваются в зеленый или коричневый цвет, зерна волютина - в вишнево-красный. В препарате, обработанном щелочью, волютин обесцвечен — пустоты на фоне слабо окрашенных бактерий.
Окраска по Раскиной.
На препарат наливают краситель, состоящий из карболового фуксина Циля -4 мл, насыщенного раствора метиленового синего-4 мл, ледяной уксусной кислоты-5 мл, 95° спирта-95 мл, дистиллированной воды -до 200 мл. Препарат подогревают на пламени до сгорания спирта, а затем промывают водой и высушивают. Бактерии окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина - в черно-синий.
Окраска капсул.
Окраска капсул микробов может иногда иметь диагностическое значение. В мазках из органов или из тканей жидкости капсулы можно обнаружить при помощи гростой окраски щелочным или другими растворами метиленового синего. Однако специальные окраски дают более четкие препараты.
Окраска по Бурри.
На середине предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и микроскопируют. На черном фоне видны неокрашенные микробы, капсулы, жгутики.
Окраска по Ольту.
Приготовляют ex tempore 2% раствор сафранина в горячей воде и фильтруют его. Фиксированный мазок окрашивают сафранином при подогревания в течение 1-2 минут. Промывают, высушивают. Препарат рассматривают в воде: на мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом, на него кладут иммерсионное масло. Тело бактерии и капсула различно преломляют лучи света. Эта разница усиливается при прохождении лучей через слой воды.
Тела микробов окрашиваются в оричнево-красный цвет, капсулы -в бледно-желтый.
Окраска по Антони.
Мазок красят (без фиксации!) на холоду 1% водным раствором кристалвиолета 2 минуты. Затем промывают 20% водным раствором CuSO4 и высушивают фильтровальной бумагой. Бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, капсулы - в сине-фиолетовый.
Окраска по Гиссу.
Препарат, фиксированный любым способом, кроме жара, красят 5% водным раствором генцианвиолета, подогрева до появления паров. Мазок промывают 20% водным раствором медного купороса и сушат. Бактерии и капсулы окрашиваются в фиолетовый, цвет.
Окраска по Гинсу.
Мазок, покрашенный тушью по Бурри, фиксируют сулемой, метиловым спиртом или на пламени. После промывки водой красят 5-10 минут карболовым раствором тионина или фуксина и вновь промывают, а затем высушивают.
Бактерии фиолетовые или красные. Фон черный. Капсулы неокрашенные!
Окраска спор.
Наиболее простой метод подобен окраске кислотоустойчивых бактерий. Препарат, приготовленный обычным способом, при нагревании окрашивают 1—2 минуты карболовым фуксином Циля, промывают водой и обесцвечивают, погружая стекло в 2% раствор азотной кислоты в спирте или в 1 % водный раствор серной кислоты. Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате не было видно следов красителя. Затем промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего.
Споры окрашивают в красный цвет.
Способ Ожешки.
На нефиксированный мазок наливают 0,5% раствор соляной кислоты и подогревают 1—2 минуты. С препарата сливают кислоту, промывают его водой и после высыхания фиксируют на пламени.
Фиксированный препарат красят по способу Циля — Нильсена. В результате тела бактерий окрашиваются в синий цвет, споры — в красный
Окраска по Биттеру.
Нефиксированный мазок, обработанный 10% раствором формалина (10 минут), промытый водой и высушенный, красят аммиачным метиленовым синим (20 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего, 3 мл крепкого Nh5OH и 80 мл дистиллированной воды) 3 минуты, нагревая стекло до закипания жидкости. После промывания водой и высушивания докрашивают мазок везувином или сафранином 3—5 минут. Вновь промывают, высушивают и микроскопируют. В окрашенном этим способом мазке бактерийные тела красные или буро-желтые (в зависимости от краски, примененной для докрашивания), споры синие.
Метод Шеффера и Фултона.
На препарат, фиксированный жаром, наносят 5% водный раствор малахитового зеленого и нагревают до появления паров 3—4 раза. Мазок промывают и докрашивают 30 секунд 0,5% водным раствором сафранина. При этой окраске споры зеленые, а клетки красные.
Метод Пешкова.
На мазок, фиксированный жаром (над пламенем!), наливают синьку Леффлера и подогревают стекло до закипания краски. Дают 15—20 секунд покипеть, а затем (после того как стекло остынет!) промывают водой и докрашивают препарат 30 секунд 0,5% водным раствором нейтральрота. Вновь промывают, сушат и микроскопируют; споры голубые, клетки розовые.
Окраска жгутиков.
Это одна из наиболее трудных процедур в бактериологической технике, так как жгутики очень легко повреждаются при приготовлении препарата. Поэтому здесь требуется особая тщательность работы. Стекла для препаратов должны быть абсолютно чисты и обезжирены. Обычно работают с новыми покровными стеклами, которые предварительно кипятят в течение 10 минут в хромовой смеси (двухромовокислого калия 20 г, воды 200 мл, серной кислоты 20 мл; приливать в указанном порядке). После кипячения стекол хромовую смесь сливают, промывают стекла 5 минут в слабом растворе едкого натра, после чего обильно промывают водой, ополаскивают спиртом и хранят в спирте (во время промывания не прикасаться к стеклам руками). Перед употреблением стекла вынимают из спирта чистым пинцетом и удаляют спирт обжиганием (ничем не вытирать!).
Исследуемая культура должна быть не старше 12—18 часов. Материал берут осторожным прикосновением петли к культуре и вносят в пробирку с несколькими миллилитрами водопроводной воды, погружая петлю в воду и держа ее неподвижно некоторое время. Повторяют это 2—3 раза, пока не получится тонкая, лишь слегка опалесцирующая взвесь. Полученной взвеси дают постоять 15—20 минут в термостате для равномерного распределения микробов в воде. Затем платиновой петлей кладут каплю из нее на покровное стекло. Если стекло достаточно чисто, капля принимает правильную круглую форму, легко расплывается и быстро высыхает на воздухе без подогревания. Препараты фиксируют на огне и окрашивают специальными способами, причем перед окраской обрабатывают протравой, которая усиливает действие краски.
Серебрение по Морозову.
Приготовляют 3 реактива:
1) 1 мл ледяной уксусной кислоты + 2 мл продажного формалина + 100 мл дистиллированной воды;
2) 5 г танина + 1 мл жидкой карболовой кислоты (liquefaciens) + 100 мл дистиллированной воды;
3) 5 г кристаллического азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой сосуд, к оставшимся 80 мл раствора серебра по каплям добавляют раствор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется легкая опалесценция; если аммиака будет добавлено слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо по каплям добавлять до получения нужной слабой опалесценции. Для окраски препарата раствор серебра разводят дистиллированной водой 1:10.
Окраска препарата: наливают на 1 минуту первый реактив, сливают, промывают препарат водой, наливают второй реактив, подогревают на легком пламени до отхождения паров (1 минуту), тщательно промывают водой, 1—2 минуты при подогревании обрабатывают препарат третьим реактивом до появления темно-коричневой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают. Рассматривают с иммерсионной системой.
Метод Бениньетти.
Готовят 3 раствора за 2—3 дня до окраски:
1) сульфата цинка 1 г, танина 15 г, дистиллированной воды 100 мл.
2) насыщенный горячий водный раствор квасцов;
3) насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета.
Непосредственно перед окраской растворы смешивают в пропорции 1-й, 2-й, 3-й = 5:5:3. Наливают на фиксированный мазок смешанную краску и подогревают над пламенем 2—3 минуты до появления паров. Тщательно обмывают водой и просушивают. Рассматривают с иммерсионной системой.
Метод Леффлера.
За 1—2 суток до употребления готовят протраву, состоящую из 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 10 мл 20% водного раствора танина, 5,5 мл насыщенного на холоду водного раствора сернокислого закисного аммиачного железа (соль Мора). Перед употреблением фильтруют.
Препарат, приготовленный на покровном стекле, фиксируют и помещают на часовое стекло.
Наливают протраву и 30—50 секунд подогревают до отхождения паров. Дав стеклу остыть, его промывают водой и, поместив на другое часовое стекло, красят фуксином Циля 2—3 минуты при слабом подогревании.
После тщательной промывки и высушивания препарат готов для микроскопирования.
Метод Шенка.
Протраву, состоящую из двух растворов, готовят за 7—10 дней до употребления.
Первый раствор состоит из 30 мл насыщенного водного раствора танина и 10 мл 5% водного раствора полуторахлористого железа, второй — из 1 мл анилина и 4 мл 95° спирта.
Протраву готовят на препарате, для чего на него наносят 8 капель первого и 1 каплю второго раствора. После того как избыток протравы сливают, на препарат наносят краску (без промывания). Красить можно 1% сафранином в 50% спирте или метиленовым синим Леффлера. Хорошие результаты можно получить, применив для окраски смесь 30 мл метиленового синего Леффлера и 8 мл второго раствора протравы.
Метод Грея.
Растворы, составляющие протраву, смешивают за сутки до употребления.
Растворы состоят из:
1) насыщенного водного раствора калийных квасцов KAl(S04)2 *12Н20 — 5 мл, 20% водного раствора танина — 2 мл и насыщенного водного раствора двухлористой ртути HgCl2 —2 мл;
2) насыщенного спиртового раствора основного фуксина — 0,4 мл.
Протраву наливают на препарат на 8-10 минут, затем промывают его дистиллированной водой и окрашивают 5 минут карболовым фуксином Циля. Вновь промывают водой, сушат на воздухе и микроскопируют. Жгутики окрашиваются в красный цвет.
Метод Петрука.
Является модификацией метода Грея. Вместо карболового фуксина применяют азотнокислое серебро, раствор которого готовят следующим образом: 1 г AgN03 растворяют в 20 мл дистиллированной воды, к нему по каплям добавляют 5% раствор аммиака до растворения образовавшегося осадка и появления легкой опалесценции. Этот исходный раствор разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и применяют для окраски. Препарат с нанесенным на него раствором азотнокислого серебра слегка подогревают над пламенем. Жгутики окрашиваются в желто-коричневый цвет.
Окраска клеточной стенки.
При обычных методах окраски мазков клеточная стенка не окрашивается. Поэтому применяют специальные методы с протравами.
Метод Гутштейна.
Препарат, 1—2 часа фиксированный в жидкости Буэна, 2—3 минуты подвергают действию протравы (5—10/0 водный раствор танина), ополаскивают водой и затем микроскопиругот в капле 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового.
Метод Кнайзи.
Препарат, фиксированный жаром, обрабатывают 3—5 минут протравой, состоящей из 70 мл насыщенного водного раствора калийных квасцов и 30 мл 20% водного раствора танина. На мазок, промытый водой, наносят каплю карболового фуксина, накрывают покровным стеклом и микроскопируют, не удаляя краску.
Метод Пешкова.
Препарат фиксируют 15 минут в жидкости следующего состава: 90° спирта 60 мл, хлороформа 30 мл и уксусной эссенции 10 мл. Протравливают 2—5 минут в 10% водном растворе танина. Затем препарат промывают водой, красят 30—60 секунд фуксином Пфейффера и, не промывая, сушат и микроскопиругот.
Окраска ядерных элементов.
Метод Романовского.
Препарат фиксируют метиловым спиртом, спирт-формолом, жидкостью Карнуа или смесью Никифорова. Окрашивают рабочим раствором красителя (2 капли продажного красителя Гимзы на 1 мл дистиллированной воды) 10—20 минут. Промывают дистиллированной водой и после просушивания микроскопируют.
Дистиллированная вода, применяемая для разведения красителя, должна иметь нейтральное значение рН, так как от этого в высокой степени зависят результаты окрашивания. Реакция дистиллированной воды, кроме обычно применяемых с этой целью способов, может быть проверена путем прибавления к ней кристаллика гематоксилина или нескольких капель его спиртового раствора. Вода пригодна если в течение 2 минут не появляется розовая окраска; в противном случае она кислая и должна быть подщелочена 1% раствором углекислой соды (NaHC03).
При микроскопии ядерные элементы имеют красно-фиолетовый цвет, цитоплазма—слабо розовый.
Метод Пикарского.
Препарат обрабатывают 1 N НС1 7 минут при подогревании до 60". После промывания мазок окрашивают по Романовскому. После окраски ядерные элементы темно-красные, протоплазма розовая.
labx.narod.ru
Окраска по Граму
Это основной способ, использующийся в бактериологии.
Основан на реакции основного парарозанилинового красителя (например, кристаллического фиолетового, метилового фиолетового или их смеси, так называемого генцианвиолета) с йодом.
Продуктом этой реакции является нерастворимое соединение темно-красного цвета в клеточной стенке бактерий. Это вещество удаляется обесцвечивающими растворителями (такими, как ацетон или спирт). Степень обесцвечивания зависит от структуры и толщины клеточной стенки.
Для демонстрации обесцвеченных микроорганизмов используют более светлый докрашивающий краситель.
Грамположительные микроорганизмы устойчивы к обесцвечиванию и остаются темно-пурпурными. Эта устойчивость не постоянна, и при продолжительном обесцвечивании краситель все же смывается.
Грамотрицательные микроорганизмы, как и весь цитологический препарат, окрашиваются в розовый цвет.
В культурах и образцах, содержащих грамположительные микроорганизмы, может содержаться какое-то количество грамотрицательных клеток, особенно если образцы старые.
В литературе описано 4 различных схемы окраски по Граму. Ключевыми моментами являются только порядок добавления реагентов, время обесцвечивания и тщательное удаление всех реагентов.
Существуют готовые наборы для окраски по Граму, к которым должна прилагаться инструкция от производителя.
Методика
1. Зафиксируйте мазок, проведя его несколько раз над пламенем
2. Залейте мазок 0,5% метиловым фиолетовым или 1% кристаллическим фиолетовым и оставьте на 1 минуту
3. Смойте водой
4. Залейте мазок 1% йодным раствором люголя и оставьте на 1 минуту
5. Смойте водой
6. Залейте 95% спиртом и осторожно покачайте, пока краска не перестанет смываться с мазка. Это займет не менее 30 секунд. Если мазок очень толстый, можно добавить свежий спирт для ускорения обесцвечивания.
7. Промойте стекло однократно водой
8. Покрасьте мазок 0,5% основным фуксином в течение 30 секунд, 0,1% нейтральным красным в течение 2 минут, или 0,5% сафранином в течение 10 секунд.
Примечания
- Для обесцвечивания можно использовать ацетон. Он действует быстрее, чем спирт (2 секунд бывает достаточно), но есть опасность слишком сильного обесцвечивания.
- Ацетон более опасен при попадании на кожу или на одежду.
Видео
Статьи по теме:
Другие статьи:
doktorvet.com
 |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |  |
 Пример видео 3 |  Пример видео 2 |  Пример видео 6 |  Пример видео 1 |  Пример видео 5 |  Пример видео 4 |
Администрация муниципального образования «Городское поселение – г.Осташков»