172735 Тверская обл., г.Осташков, пер.Советский, д.З

Версия для слабовидящих

Администрация МО

Город Осташков

Тверская область

Телефон:
+7 (48235) 5-68-17

[email protected]

10.2 Изучение псевдомицелиальной структуры дрожжей. Морфологические признаки дрожжей

Цель 1. Изучить морфологические признаки и систематику дрожжей

⇐ ПредыдущаяСтр 10 из 38Следующая ⇒

4.1. Морфология дрожжейДрожжи относятся к голосумчатым грибам (Protascales). Они плодовых тел не имеют, и сумки образуются прямо из зиготы.

Дрожжевые грибы представляют собой одноклеточные неподвижные организмы овальной или удлиненной формы гораздо больших размеров (8-10 мк), чем бактерии (1-3 мк). Истинного мицелия обычно не образуют. Ядро дифференцировано, размер его до 2 мк, оно окружено тонкой оболочкой, имеет более плотную кариосому. В составе ядра имеется типичная дезоксирибонуклеиновая кислота. Ядро делится митозом, реже амитозом. В дрожжевой клетке есть также особые в виде зерен или удлиненные тельца - митохондрии, имеющие прямое отношение к энергетическому обмену клетки. В вакуолях клетки накапливается повышенное количество различных солей и органических веществ, здесь происходят энергичные окислительно-восстановительные процессы. При обильном питании в клетках откладывается в большом количестве волютин.

Вегетативное размножение дрожжей происходит главным образом почкованием, реже у некоторых видов делением. При почковании на каком-либо месте клетки появляются выросты - почки, которые дают начало новой клетке со всеми составными ее частями. Процесс почкования длится около двух часов. При делении в середине клетки развивается перегородка, которая делит ее пополам.

Спорообразование наступает после многократного размножения почкованием или делением. Оно легче осуществляется при резком переходе от обильного питания к скудному, но при достаточном доступе кислорода. В большинстве случаев споры образуются без оплодотворения (партеногенетически). При этом в одной клетке образуется четное число спор (чаще 4-8). Споры в лаборатории получают на специальных гипсовых блоках или на среде Городковой, содержащей 0,25 г глюкозы.

Предварительный половой процесс наблюдается не у многих видов (Saccharomyces Ludwigii и др.). Две смежные клетки образуют выросты, которые сближаются друг с другом. На месте соединения выступов оболочка растворяется, содержимое клеток сливается, и образуется зигота. Происходит редукционное деление, затем еще 2-3 деления, в результате чего получается 8 или 4 аскоспоры. Клетка, образовавшаяся в процессе слияния двух дрожжевых клеток, и является сумкой. После некоторого периода покоя споры прорастают и вновь размножаются почкованием или делением См. рис.1).

Систематика дрожжей основана на ряде морфологических и физиологических признаков. Различают 2 семейства:

1. Saccharomycetaceae. Размножение происходит почкованием, образованием сумок со спорами и у немногих родов делением. В этом семействе наиболее важное значение имеет род Saccharomyces, к которому относятся представители дрожжей, широко используемых в промышленности - винокурении, хлебопечении, пивоварении, производстве глицерина и др.

2. Non Saccharomycetaceae. Размножение только почкованием, без спорообразования. Сюда относится род Torula, некоторые виды которого используются для приготовления кефира, кумыса, "кормовых дрожжей".

Рисунок 1. Дрожжи: 1-5 - Saccharomyces cerevisiae, 1 - цепочка почкующихся дрожжей, 2 - отдельная клетка, 3, 4, 5 - почкующиеся клетки, 6-10 - Saccharomyces octosporus; 6, 7, 8 - половой процесс, 9 - деление копуляционного ядра; 10 - сумка с 8 аскоспорами

Дрожжи имеют разнообразную форму: круглую, эллиптическую, овальную, реже лимонообразную и цилиндрическую, иногда сильно вытянутую в виде гиф(см. рис.2).

Рисунок 2. Форма и структура дрожжевых леток

Форма и строение дрожжевых клеток непостоянна, она может изменяться в связи с изменением условий культивирования. Дрожжевая клетка состоит из клеточной мембраны, цитоплазмы, внутри которой расположены органоиды (ядро, митохондрии, рибосомы, вакуоль, Гольджи аппарат) и включения (запасные вещества) в виде капелек жира, зерен гликогена и волютииа (рис. 3).

Рисунок 3. Строение дрожжевой клетки.

Молодые клетки имеют гомогенную цитоплазму, иногда небольшую вакуоль. С возрастом клетки появляется зернистость, вакуоль увеличивается. Размер клеток варьирует от 5 до 7 мкм в диаметре и от 8 до 12 мкм в длину. При таких небольших размерах клеток поверхность их в 1 л бродящего виноградного сусла может достигать 10 м2. Такая большая поверхность определяет активный обмен дрожжей с окружающей средой. Относит, плотность клеток составляет 1,055-1.06. С наступлением неблагоприятных условий возникают более устойчивые покоящиеся клетки - артроспоры и сумки со спорами. Артроспоры сохраняют форму вегетативных клеток, но отличаются от них более плотной плазмой, наличием гликогена, капель жира и утолщенными оболочками. Сумки со спорами обычно повторяют форму и размер вегетативных клеток. Форма и размер спор у различного рода спорегенных дрожжей отличаются.

Систематика дрожжей.Систематика дрожжей основана на различии их способов размножения и физиологических признаков. Дрожжи подразделяются на два семейства: сахаромицеты и несахаромицеты.

Сахаромицеты. Они объединяют истинные дрожжи, к числу которых относятся культурные дрожжи, используемые в промышленности (пекарские, винные, винокуренные и др.).

Большое значение имеют следующие виды культурных дрожжей: сахаромицес церевизи и сахаромицес эллипсоидес.

Дрожжи сахаромицес церевизи имеют шаровидную или яйцевидную форму, используют их для получения винного спирта, в пивоварении, квасоварении и хлебопечении. Существует несколько разновидностей этих дрожжей, называемых расами. Каждая раса имеет свои особенности и потому используется в промышленности с определенной целью. Раса, обладающая способностью быстро и полно сбраживать сахар при температуре около 30°С и устойчивая к спирту, применяется для получения спирта. Другая раса, способная вызывать медленное брожение при температуре 4-10°С, используется в пивоварении.

Дрожжи, обладающие высокой энергией брожения и подъемной силой и способные быстро размножаться, применяются в хлебопечении.

Дрожжи сахаромицес эллипсоидесимеют эллипсоидную форму и применяются в виноделии. Различные расы этих дрожжей обладают способностью придавать винам специфические вкусовые и ароматические оттенки, т.е. создавать так называемый букет.

Несахаромицеты. Эти микроорганизмы включают в себя ложные дрожжи. Многие из них являются вредителями различных производств. Среди этих дрожжей наиболее важны дрожжи родов торула и микодерма.

Дрожжи рода торула имеют шаровидную форму и способны вызывать слабое спиртовое брожение. Торула кефир применяется для приготовления молочнокислых продуктов, содержащих спирт (кефира и кумыса), а торула утилис - для получения пищевых и кормовых дрожжей.

Дрожжи рода микодерма представляют собой удлиненные клетки. Они не способны вызывать спиртовое брожение, но могут окислять спирт, а также органические кислоты в углекислый газ и воду. Развиваясь на поверхности алкогольных напитков, микодерма образует морщинистые пленки и придает напиткам неприятный вкус и запах. Микодерма вызывает порчу молочнокислых продуктов, квашеных овощей, наносит вред в производстве уксуса и пекарских дрожжей.

4.2.Морфология дрожжей торула, микроорганизмов вызывающих спиртовое брожение

Суммарное уравнение спиртового брожения идрожжи их вызывающие. Спиртовое брожение –это процесс превращения в анаэробных условиях сахара в диоксид углерода и этиловый спирт.. Грибы в анаэробных условиях накапливают спирт. Уравнение спиртового брожения в общем виде выглядит следующим образом:

С6 Н12 О6 2 СО2 + 2С 2Н5ОН

Расчет, основанный на учете молекулярных весов сахара и, спирта, показывает, что из каждой весовой единицы углевода теоретически возможно образование лишь около половины спирта: Суммарное уравнение спиртового брожения не раскрывает всей сложности процессов превращения сахара в спирт и углекислый газ, а также того, что, кроме главных продуктов брожения, обычно еще образуются в некотором количестве побочные продукты - янтарная и уксусная кислоты, глицерин, уксусный альдегид, сивушные масла (смесь изомеров высших спиртов - амилового, изобутилового, бутилового и прочих), а также ряд веществ, от присутствия которых даже в ничтожных количествах зависят специфические вкус и аромат вина, пива и других продуктов.

На промежуточных этапах брожения появляются такие соединения, как трифосфороглицериновый альдегид СН2О(Н2РО3) и пировиноградная кислота СН3СОСООН, которая в последующей стадии спиртового брожения декарбоксилируется под влиянием фермента пируватдекарбоксилазы и превращается в уксусный альдегид и углекислый газ:

Уксусный альдегид с помощью восстановленной формы фермента алкогольдегидрогеназы восстанавливается в этиловый спирт:

Эта реакция иллюстрирует завершающий этап спиртового брожения. Постоянное присутствие среди продуктов брожения глицерина объясняется восстановлением части трифосфоглицеринового альдегида еще на промежуточных этапах в соответствующий спирт - глицерин по схеме, аналогичной восстановлению уксусного альдегида. Химизм спиртового брожения несколько меняется под действием различных факторов. В щелочной среде, кроме спирта, образуется уксусная кислота. Прибавление бисульфита натрия к бродящей жидкости приводит к образованию, кроме спирта, значительных количеств глицерина и уксусного альдегида.

.Дрожжи сбраживают не все сахара. Обычно они хорошо усваивают гексозы. Пентозы могут ассимилировать лишь весьма ограниченное число видов. Неплохо используют дрожжи дисахариды, но каждый вид микроорганизма способен усваивать лишь строго определенный их набор. Перед сбраживанием более сложные сахара под влиянием ферментов дрожжевой клетки распадаются на моносахариды.

Отдельные виды могут усваивать простые декстрины. Крахмал становится пригодным для спиртового брожения лишь после предварительного осахаривания при помощи солода (или другими способами). На многих заводах для спиртового брожения используют целлюлозу, предварительно подвергая ее кислотному гидролизу. В аэробных условиях дрожжи способны окислять органические кислоты и другие соединения.

Источником азотного питания для дрожжей служат небольшие пептиды, аминокислоты, а также аммонийные соли, реже нитраты и нитриты. Дрожжевая клетка вырабатывает многие витамины, а присутствие отдельных ростовых веществ в среде усиливает рост дрожжей. Большинство дрожжей растет в границах рН 3-8 при оптимуме рН 3,5-6,5. Обычно они развиваются в относительно широком температурном диапазоне от 0 (или -7°С) до 50°С. Оптимальная температура для роста большинства видов 28-30°С.

Штаммы Saccharomyces cerevisiae подразделяют на расы верхового и низового брожения. Первые используют для брожения, протекающего при температуре 14-25°С. В таких условиях обильно выделяется диоксид углерода, наблюдается пенообразование. Клетки микроорганизмов поднимаются на поверхность бродящей жидкости. Верховые расы используют в спиртовой промышленности, хлебопечении и т.д., но при некоторых условиях употребляют и другие дрожжи.

Дрожжи низового брожения применяют в производстве при температуре 6-10°С и ниже (до 0°С). При этом брожение совершается спокойно и масса дрожжевых клеток остается на дне сосуда. Низовые расы обычно используют в пивоварении и виноделии, где применяют расы Saccharomyces cerevisiae, адаптированные, однако, к жизнедеятельности при пониженной температуре. В виноделии важную роль играют также дрожжи Saccharomyces vini, S. cerevisiae var. ellipsoides. Как указывалось выше, дрожжи могут расти при нейтральной реакции среды, но активнее процессы идут при некотором подкислении. На практике для предупреждения развития посторонней бактериальной микрофлоры при размножении дрожжей создают кислую среду.

На условия спиртового брожения в присутствии дрожжей влияют многие факторы: химии еский состав сбраживаемой среды, т.е. полноценность, концентрация и кислотность среды, содержание спирта, температура,, наличие посторонних микроорганизмов. Этиловый спирт , образующийся в процессе брожения , неблагоприятно влияет на дрожжи. Накопление дрожжами спирта в концентрации 2-5% в зависимости от вида и расы дрожжей действует на них уже угнетающе. В большинстве случаев брожение прекращается при накаоплении дрожжами 12… 14% (объемных) спирта.

Использование спиртового брожения лежит в основе производства этилового спирта, пива, вина и пекарских дрожжей.

Пекарские дрожжи (расы Sacch.cerevisiae) прессованные и сухие для производства хлебобулочных изделий получают на специализированных дрожжевых заводах. При получении пекарских дрожжей в качестве питательной среды используют очищенную и разбавленную водой свекловичную мелассу – отход от свеклосахарного производства. К свекловичной мелассе, содержащей все необходимое для дрожжей, дополнительно добавляют азот- и фосфорсодержащие соли. Дрожжи, размножающиеся при температуре около 30О С, рН 4,5…5,5, при непрерывной аэрации.. Дрожжи дышат и активно размножаются, а не бродят. Большая часть сахара используется ими для синтеза веществ клетки. Выросшую массу дрожжей отделяют от среды, промывают водой, сушат и прессуют до содержания влаги 73…75%. Полученную дрожжевую массу формуют в виде брикетов с содержанием дрожжевых клеток от 8 до млрд. в 1 г. Брикеты упаковывают в бумагу и охлаждают до температуры 4о С, Сухие дрожжи выпускают влажностью 8-10 . Сохранять прессованные дрожжи следует на холоде.

arhivinfo.ru

Морфологические признаки дрожжей — Студопедия.Нет

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 11Следующая ⇒

Форма вегетативных клеток разнообразна: округлая, овальная, яйцевидная, цилиндрическая, апикулятная или лимоновидная. Несовершенные дрожжи имеют более характерную форму, отличающуюся от других видов: стреловидную, треугольную. Дрожжи некоторых родов наряду с округлыми и овальными клетками могут образовывать длинные клетки псевдомицелия.

В среднем размер клеток дрожжей, применяемых в пищевой промышленности, колеблется от 2,5 в поперечнике до 5 мкм и длина от 4,5 до 21 мкм. Формы и размеры дрожжевых клеток зависят от вида, возраста, питательной среды, способа культивирования. Для изучения морфологии дрожжи выращивают на стерильном солодовом сусле концентрацией 8-10 % СВ, сусло-агаре, глюкозопептонной жидкой среде или глюкозопептонном агаре в течение 2-3 суток при 25-28 оС. Медленнорастущие дрожжи микроскопируют через 1-2 недели. Затем культуры оставляют при комнатной температуре и еще раз описывают через 4 недели.

Выявление включений клетки

Гликоген - это запасной полисахарид, мономером которого является α-D-глюкоза, который обнаруживают при помощи прижизненной окраски дрожжевых клеток раствором иода или Люголя. Количество гликогена в клетках дрожжей меняется в зависимости от их возраста и условий питания. Гликоген появляется в клетках, находящихся в стационарной фазе роста, в период главного брожения, и накапливается в большом количестве, когда 2/3 сахаров сусла сброжены. Если же весь сахар сусла сброжен, то гликоген в дрожжах перестает накапливаться.

Техника определения. Для определения количества гликогена в дрожжевых клетках на предметное стекло, предварительно протертое марлевой салфеткой, наносят маленькую каплю воды (можно наносить петлей). Далее добавляют петлей небольшое количество биомассы дрожжей – еле заметное глазом на конце петли – (или 1 каплю дрожжевой суспензии) и 2 капли 0,5 % раствора иода (0,5 г иода и 1 г KI на 100 мл воды). Капли смешивают, накрывают подготовленным покровным стеклом, отбирают излишек жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют, используя объектив микроскопа 40х. При соотношении дрожжей и раствора иода (1:2) через 2-3 мин клетки дрожжей окрашиваются в светло-желтый цвет, а гликоген – в коричневый. Можно добавлять еле заметное количество биомассы дрожжей в каплю раствора Люголя.

В нормальных зрелых дрожжах гликоген занимает от 2/3 до 1/3 клетки. Если гликоген окрашен слабо и занимает меньше 1/4 клетки, считают содержание гликогена недостаточным. У очень молодых дрожжей гликоген отсутствует, при окрашивании раствором иода (раствором Люголя) под микроскопом видны клетки бледно-желтого цвета. Это указывает на то, что дрожжи еще не готовы и их рано передавать на брожение. В перестоявшихся или плохо упитанных дрожжах гликоген отсутствует или содержится в небольшом количестве.

Волютин (метахроматин) – запасной полифосфат в соединении с простыми белками и рибонуклеиновой кислотой. Он является источником фосфора, необходимым для построения АТФ – получения энергии.

Техника определения. Для определения волютина готовят фиксированный препарат. На обезжиренное предметное стекло наносят петлей каплю воды, в нее вносят петлей еле заметное количество биомассы дрожжей или каплю культуральной жидкости, содержащей клетки дрожжей. Содержимое перемешивают и размазывают петлей по поверхности предметного стекла. Полученный мазок высушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки. Мазок заливают карболовым фуксином Циля и окрашивают 0,5-1 мин. Краску сливают, препарат промывают водой и обесцвечивают в течение 20-30 с 1 %-ым раствором серной кислоты. Мазок промывают водой, накладывают на него фильтровальную бумагу для удаления излишков влаги. Можно на влажный мазок наложить предварительно протертое от пыли покровное стекло. Далее мазок микроскопируют, используя объектив микроскопа 40х. Зерна метахроматина окрашиваются в красный цвет.

При окраске метиленовой синью (в соотношении 1:10) фиксированных препаратов метахроматиновые зерна окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, протоплазма – в голубой. При последующей обработке препарата 5 %-ым раствором соды метахроматиновые зерна обесцвечиваются, а протоплазма остается окрашенной в голубой цвет. Обработка препарата 1 %-ым раствором серной кислоты приводит к противоположному результату: обесцвечивается протоплазма, а метахроматиновые зерна сохраняют окраску.

Жир – запасное вещество, обнаруживаемое в основном в старых клетках, растущих на богатой питательными веществами среде. Представляет собой триглицериды, и служит резервным источником энергии.

Техника определения. Для определения жира клетки дрожжей окрашивают суданом III или 1 %-ым раствором осмиевой кислоты следующим образом. На предметное стекло наносят (лучше всего петлей) небольшую каплю 40 %-ого раствора формалина. Петлей в каплю вносят культуру дрожжей. Формалин убивает клетки дрожжей и делает клеточную оболочку проницаемой. Через 5 мин добавляют небольшую каплю метиленовой сини, еще через 10 мин каплю свежеприготовленной смеси равных объемов спиртового раствора судана III и воды (можно каплю только спиртового раствора судана III). Препарат накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. Цитоплазма окрашивается в синий цвет, гранулы и капельки жира - в розово-оранжевый, вакуоли остаются бесцветными. Раствор судана III готовят на спирте или молочной кислоте: 0.1 г судана III растворяют в 20 мл 96 %-ого спирта или в концентрированной молочной кислоте. Раствор фильтруют через фильтровальную бумагу.

Окрашивание ядра. Техника определения. По методу Романовского-Гимза препарат дрожжей фиксируют 5 мин метанолом или жидкостью Карнуа. В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают спиртом и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат красителем Романовского-Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной водой (рН 7,2), высушивают и микроскопируют. Ядро окрашивается в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма - в слабо-розовый.

По методу Фельгена из суточной культуры приготавливают мазок, высушивают на воздухе и фиксируют парами 2 %-ого раствора осмиевой кислоты в течение 2-3 мин. Для фиксации на дно чашки Петри наносят 2-3 капли фиксатора, а предметное стекло помещают на маленькие стеклянные палочки мазком вниз. Далее мазок подвергают гидролизу в 1 н. растворе соляной кислоты при температуре 60 оС в течение 2-3 мин, опуская предметное стекло в небольшой химический стакан с соляной кислотой, помещенный в водяную баню. По окончании гидролиза мазок немедленно промывают водой и заливают 1 %-ным раствором формалина на 1,5 мин и вновь промывают водой. Мазок окрашивают 0,1-1,0 %-ым водным раствором основного фуксина 1-2 мин, промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. На розовом фоне цитоплазмы ядро окрашивается в ярко-малиновый цвет.

Окраска митохондрий. Для окраски митохондрий применяют краситель зеленый янус. Слабые водные растворы зеленого януса 1:5000, 1:50000 окрашивают митохондрии прижизненно и субвитально. Окраска зеленым янусом и нейтральным красным (нейтральрот) одновременно выявляет в клетках и митохондрии и метахроматин.

Техника определения. На предметное стекло нанести каплю дрожжевой суспензии, добавить каплю раствора зеленого януса, покрыть покровным стеклом, микроскопировать с использованием объектива микроскопа 40 х.

Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 7; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ

studopedia.net

Морфология дрожжей

Макроморфологические признаки очень изменчивы и сильно зависят от состава среды и условий культивирования, поэтому они имеют весьма ограниченное значение в систематике дрожжей. Дрожжевые культуры, растущие на плотных средах, по консистенции бывают чаще всего пастообразными, а также слизистыми, иногда полностью стекающими на дно пробирки, вязкими, клейкими, кожистыми или крошащимися. Слизистый рост характерен для многих анаморфных базидиомицетовых дрожжей родов Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces, образующих большое количество внеклеточных полисахаридов, а также для аскомицетовых почвенных дрожжей рода Lipomyces. У большинства аскомицетовых дрожжей колонии пастообразные, сухие, культура при росте на скошенном агаре не стекает на дно пробирки.

Для дрожжеподобных грибов, образующих как одиночные клетки, так и мицелий, характерны колонии с ворсинчатым краем, который хорошо просматривается при просвечивании. У большинства дрожжей колонии белые, часто приобретающие при старении кремовый или слегка коричневатый оттенок. У некоторых аскоспоровых дрожжей, например из рода Lipomyces, старые колонии при обильном спорообразовании темнеют и становятся бурыми или шоколадными. Многие дрожжи образуют пигменты, окрашивающие их колонии в различные цвета. Наличие каротиноидных пигментов, придающих колониям красную, розовую, оранжевую или желтую окраску, характерно для базидиомицетовых дрожжей родов Rhodotorula, Sporobolomyces и др. Аскомицетовые дрожжи Metschnikowia pulcherrima образуют диффундирующий в среду красно-вишневый пигмент пульхерримин. Так называемые «черные дрожжи», формируют темно бурые или черные колонии за счет накопления меланоидных пигментов.

Микроморфология дрожжей включает признаки, характеризующие отдельные клетки (форма, размеры), а также способы вегетативного и бесполого размножения и образуемые при этом структуры. Морфогенез дрожжевой клетки тесно связан со способом вегетативного размножения.

Различают два принципиально различных способа образования вегетативных клеток у дрожжей - артрический (талломный) и бластический (зародышевый). При артрическом способе мицелий дрожжеподобных грибов одновременно распадается на отдельные одноклеточные элементы - артроспоры. Они образуются за счет расчленения гифы по поперечным септам после разрушения первичной стенки гифы в местах сочленения. Такой способ вегетативного размножения характерен для дрожжеподобных грибов Endomyces, Galactomyces, Arxula, Trichosporon, причем у двух последних родов образование артроспор сопряжено с их последующим почкованием. Бластический тип вегетативного размножения - это образование почек, что наиболее характерно для дрожжей.

Почка представляет собой вырост на материнской клетке, который по мере увеличения в размерах отшнуровывается от нее. На материнской клетке при этом остается шрам почкования, а на отделившейся почке - шрам рождения. Шрамы почкования, или почечные рубцы, сохраняются на материнской клетке весь период ее жизни, а шрамы рождения со временем становятся малозаметными. Форма дрожжевых клеток довольно разнообразна и этот признак тесно связан со способом почкования. У видов, размножающихся многосторонним почкованием, клетки имеют сферическую, округлую, овальную или яйцевидную форму. При биполярном почковании клетки приобретают апикулятную (лимоновидную) или грушевидную форму. У делящихся дрожжей клетки более или менее цилиндрические. Специфическую угловатую форму имеют клетки дрожжей рода Trigonopsis, серповидную - Metschnikowia lunata. Клетки дрожжей, образующие почки на стеригмах, зачастую приобретают форму, делающую их похожими на простекобактерии.

У многих видов дрожжей в определенных условиях роста материнские и дочерние клетки после почкования не разъединяются, а продолжают почковаться. В результате возникают структуры, имитирующие мицелий. Такой мицелий называют ложным, или псевдомицелием. В отличие от истинного (септированного) мицелия, в нитях псевдомицелия между клетками обычно хорошо заметны перетяжки, а апикальные (концевые) клетки всегда короче предшествующих. Псевдомицелий, состоящий только из клеток одного типа, сходных по форме и размерам, называют примитивным (рудиментарным). Сложный псевдомицелий состоит из клеток более чем одного типа, обычно в нем резко различаются длинные клетки, составляющие псевдогифы, и расположенные на них одиночные или собранные гроздьями круглые, овальные или клиновидные почки, которые в этом случае называются бластоспорами. Образование псевдомицелия характерно для многих аскомицетовых дрожжей, например из родов Candida, Pichia.

Диморфизм и плеоморфизм

Для дрожжей, как и для других грибов, известны явления диморфизма и плеоморфизма. Мицелиально-дрожжевой диморфизм проявляется в том, что один вид может расти в двух формах - одноклеточной и мицелиальной. Например, у базидиомицетовых дрожжей обычно гаплоидная фаза одноклеточна, а диплоидная (дикариотическая) - мицелиальная. О явлении плеоморфизма говорят, когда в жизненном цикле одного вида существуют два или несколько видов бесполого размножения. Плеоморфизм у дрожжевых грибов выражается в том, что наряду с основным типом вегетативного размножения почкованием или делением некоторые дрожжи образуют особые бесполые структуры, предназначенные специально для распространения или сохранения вида, например:

· баллистоспоры. Это экзогенные споры (конидии), которые формируются на заостренных кончиках особых выростов - стеригм, и при созревании с силой отстреливаются за счет капельно-экскреторного механизма. Способность к образованию баллистоспор, рассеиваемых через воздушную среду, свойственна дрожжам, обитающим на наземных частях растений. Примерами могут служить дрожжи родов Sporidiobolus, Sporobolomyces и др.;

· эндоспоры, представляющие собой бесполые эндогенные клетки, формирующиеся чаще всего в гифах мицелиальных дрожжей (например, Trichosporon) из участков цитоплазмы, которые отделяются мембраной и затем образуют клеточную стенку. Процесс можно трактовать как эндогенное почкование. Количество эндоспор в одной клетке строго не фиксировано. После разрушения мицелия эндоспоры освобождаются и начинают почковаться. Эндоспоры ни по структуре, ни по устойчивости не отличаются от вегетативных клеток;

· хламидоспоры. Это крупные сферические или овальные клетки, которые образуются как из одиночных дрожжевых вегетативных клеток, так и на мицелии, по одной или цепочками. Хламидоспоры на мицелии образует, например, Candida albicans. Из дрожжевых клеток формируются хламидоспоры в старых культурах Lipomyces, Cryptococcus, Metschnikowia, Phaffia. Хламидоспоры отличаются утолщенной многослойной клеточной стенкой и высокой концентрацией запасных веществ. Биологическая функция таких структур заключается в длительном сохранении жизнеспособности в условиях голодания или низкой влажности. В средах с легкодоступными источниками энергии такие хламидоспоры прорастают путем почкования, или образуют трубки прорастания. В других случаях хламидоспоры выступают как структуры, в которых проходит кариогамия и мейоз, что ведет к образования асков (например, у Metschnikowia pulcherrima) или базидий (у базидиомицетовых дрожжей Leucosporidium, Mrakia, Rhodosporidium). В последнем случае такие структуры называют телиоспорами.

biofile.ru

14. ЛР 3 морфология дрожжей

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3-4

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ПРИЗНАКОВ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ И ДРОЖЖЕЙ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РАЗДАВЛЕННАЯ КАПЛЯ

Цель работы:

Ознакомиться с морфологическими особенностями грибов и дрожжей, встречающихся при производстве пищевых продуктов. Освоить технику микроскопического исследования грибов и дрожжей в препаратах раздавленная капля.

Оборудование, материалы:

Микроскоп; препаровальные иглы и бактериологические петли; предметные и покровные стекла; фильтровальная бумага; спиртовка; лоток с рельсами для предметных стекол; культуры грибов родов Mucor, Aspergillus, Penicillium, Alternaria; чистая культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Морфология и культуральные признаки микроскопических грибов

Микроскопические грибы относятся к надцарству эукариот, царству грибов, отделу истинных грибов и являются представителями трех из четырех классов: фикомицетов, аскомицетов и дейтеромицетов. Представители царства грибов являются аэробными микроорганизмами и по типу питания относятся к хемоорганогеторотрофам. Большинство грибов – сапрофиты, но некоторые вызывают заболевания и являются паразитами.Вегетативное тело грибов называется мицелием. Мицелий состоит из множества переплетающихся нитей-трубочек, называемых гифами. Диаметр гифов, колеблется от 5 до 50 мкм. В зависимости от строения мицелия грибы делятся на высшие и низшие. У высших грибов гифы разделены перегородками (септами) в центре которых имеется большая пора. В класс фикомицетов объединяются низшие грибы, представители классов аскомицетов и дейтеромицетов являются высшими грибами.Грибы – это циноцитные микроорганизмы. Это значит, что они растут и при этом происходят деления ядер, но не происходит клеточных делений. Таким образом, вегетативное тело гриба представляет собой одну большую многоядерную клетку.Все микроскопические грибы могут размножаться вегетативно кусочком мицелия. При бесполом размножении у фикомицетов образуются спорангиеносцы, а у аскомицетов – конидиеносцы. Дейтеромицеты могут размножаться многоклеточными конидиями.Фикомицеты и аскомицеты являются совершенными грибами. Это значит, что представители этих классов могут размножаться половым путем. Дейтеромицеты относятся к несовершенным грибам.Культуральные признаки микроскопических грибовКолонии микроскопических грибов по размерам во много раз превосходят колонии одноклеточных организмов (бактерий, грибов) и нередко разрастаются по всей поверхности питательной среды в чашках Петри. Консистенция грибных колоний различная. Чаще образуются войлокообразные и кожистые колонии, реже крошковатые. Поверхность колоний может быть пушистой, как вата, бархатистой, мучнистой, паутинообразной, нитевидной, кожистой или гладкой. При росте на плотных и жидких средах часть гифов врастает в питательную среду, образуя субстратный мицелий, а другая часть гифов образует воздушный мицелий в виде пушистого налета, видимого невооруженным глазом. Мицелий может быть также бесцветным (белым, сероватым) или окрашенным (черным, бурым, зеленым, желтым и т.д.). Пигментирован только плодоносящий мицелий.Характеристика микроскопических грибов различных классовМорфологические особенности грибов различных классов представлены на рис. 1.Род Mucor относится к классу фикомицетов. Эти грибы имеют несептированный мицелий. Они могут размножаться бесполым и половым путем с образованием спорангиеносцев (рис. 1). Снаружи спорангий покрыт тонкими шипами из кристаллов щавелевокислого кальция. При созревании спорангий разрывается, спорангиеспоры высвобождаются и разносятся воздушными потоками. На спорангиеносце после освобождения спорангия от спор остается колонка, а в нижней ее части – воротник. Цвет мицелия мукоровых грибов вначале белый, затем серовато-оливковый, вид – войлокоподобный. А

Рис. 1 Морфологические особенности грибов различных классов:а - Mucor; б - Penicillium; в - Aspergillus; г - Alternaria

Мукоровые грибы растут на поверхности влажного зерна, солода, корнеплодов, на пищевых продуктах, на стенах сырых помещений в виде сероватого пушистого налета. Mucor nigricans является возбудителем кагатной гнили сахарной свеклы. Многие мукоровые грибы используются в промышленности для производства различных органических кислот и спирта (грибы видов Mucor javanicus, Mucor racemosus), ферментных препаратов, каротиноидов, стероидов.Представители родов Aspergillus и Penicillium относятся к классу аскомицетов, который объединяет высшие микроскопические совершенные грибы. При бесполом размножении с помощью спор эти грибы образуют конидиеносцы (рис. 1). Аспергиллы и пенициллы относятся к плодосумчатым грибам. Это значит что при половом размножении у них на специальных плодовых телах образуются аски (сумки), в которых находятся 8 аскоспор.К роду Penicillium относится около половины всех плесневых грибов. Они широко распространены в почве, в воздухе плохо проветриваемых помещений и вызывают порчу различных продуктов и материалов. Этот гриб имеет ветвящийся септированный мицелий (диаметр гифов – 2-3 мкм) и септированные конидиеносцы (напоминают кисточки), которые на конце разветвляются в виде отростков – стеригм. От них отходят конидии, состоящие из цепочек спор. В зависимости от вида конидии могут быть разного цвета (белые, зеленые и др.). Многие пенициллы используются в промышленности для получения различных ценных продуктов. Среди выделенных штаммов этого рода 25 % обладают антибиотической активностью, а такие виды как Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum используются как продуценты пенициллина. Некоторые виды пенициллов используются как продуценты ферментов и липидов. В производстве мягких сыров рокфор и камамбер используются благородные плесени Penicillium roqueforti и Penicillium camamberti. Грибы рода Aspergillus насчитывают более 200 видов. Эти грибы имеют хорошо развитый ветвящийся мицелий с многочисленными септами. Конидиеносцы несептированы, верхние их концы грушевидно или шаровидно расширены в виде небольшой головки. На головке располагаются кеглеобразные стеригмы с цепочками конидий, которые напоминают струйки воды, выливающиеся из лейки. Отсюда возникло название леечная плесень (aspergere по латыни – поливать, опрыскивать). Конидии аспергиллов при созревании приобретают различную окраску, что наряду с другими признаками определяет их видовую принадлежность. Так же как и пенициллы, представители рода Aspergillus широко распространены в природе и играют важную роль в минерализации органических веществ. Они вызывают плесневение многих пищевых продуктов. Эти грибы являются продуцентами многих ценных веществ и широко используются в промышленности. Так, Aspergillus niger, применяют в промышленности для производства лимонной кислоты; Aspergillus terreus – итаконовой кислоты Aspergillus flavus и Aspergillus terricola образуют наиболее активный комплекс протеолитических ферментов; Aspergillus oryzae и Aspergillus awamori являются лучшими продуцентами амилолитических ферментов.Грибы рода Alternaria относятся к классу несовершенных грибов – дейтеромицетов. Это высшие грибы. Они имеют септированный мицелий и короткие несептированные конидиеносцы, на которых находятся многоклеточные конидии грушевидной или лимоновидной формы (рис. 1). Гриб является возбудителем черной гнили – болезни корнеплодов и плодов, а также возбудителем порчи пищевых продуктов.

Морфология дрожжей и их характеристикаДрожжи – это высшие одноклеточные грибы. Большинство дрожжей относится к двум классам грибов – аскомицетам и дейтеромицетам. Дрожжи по отношению к кислороду делятся на факультативные анаэробы (в аэробных условиях осуществляют дыхание и активно накапливают биомассу, а в анаэробных условиях вызывают спиртовое брожение) и аэробы.Морфологически дрожжи разнообразны. Они отличаются друг от друга размерами и формой клеток. Размеры клеток дрожжей в зависимости от вида варьируют в следующих пределах; от 2,5 до 10 мкм в поперечнике и от 4 до 20 мкм в длину. Морфологическое разнообразие форм дрожжей изображено на рис. 2. а

Рис. 2 Формы дрожжевых клеток: а - овальная яйцевидная; б - цилиндрическая; в – апикулятная; лимоновидная; г – стреловидная;д – треугольная; е – серповидная; ж – колбовидная; з, и - мицелевиднаяФорма и размеры дрожжевых клеток зависят от вида, возраста, питательной среды, способа культивирования.Размножаются вегетативным и половым путем. Способы размножения – почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам относятся представители культурных дрожжей рода Saccharomyces (сахаромицеты). К делящимся – виды рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. В каждой сумке образуется от 2 до 8, иногда 12 спор. Среди дрожжей есть аспорогенные, ложные дрожжи, не способные к половому процессу и спорообразованию. Они относятся к классу несовершенных грибов.Из дрожжей, относящихся к классу аскомицетов, большое значение имеют дрожжи-сахаромицеты рода Saccharomyces (сахаромицеты), которые широко используются в пищевой промышленности. Главным биохимическим признаком этих дрожжей является то, что они сбраживают сахара с образованием этилового спирта и диоксида углерода. Дрожжи, используемые в промышленности, называются культурными дрожжами. Так, в хлебопекарном производстве и в производстве спирта используются верховые дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи вида Saccharomyces minor нашли применение в производстве ржаного хлеба и кваса. В пивоварении используются низовые дрожжи Saccharomyces carlsbergensis. Дрожжи-сахаромицеты имеют овальную форму, вегетативно размножаются почкованием, в неблагоприятных условиях размножаются половым путем аскоспорами.Некоторые спорогенные дрожжи являются дикими дрожжами. Эти дрожжи так же, как и культурные, способны осуществлять спиртовое брожение, но помимо спирта образуют много побочных продуктов (таких как альдегиды, высшие спирты, эфиры и др.) и поэтому ухудшают органолептические показатели продукта. Эти дрожжи являются вредителями производства различных напитков (пива, вина, безалкогольных напитков), а также возбудителями порчи многих пищевых продуктов. Дрожжи - дейтеромицеты могут размножаться только вегетативным способом. Некоторые из этих дрожжей (например, дрожжи рода Candida) используются в промышленности для получения кормового белка, органических кислот, витаминов и других продуктов микробного синтеза. Дрожжи вида Torulopsis kefir входят в состав симбиотической закваски – кефирного грибка. Другие представители несовершенных (аспорогенных) дрожжей являются дикими дрожжами и вызывают порчу многих пищевых продуктов. К дрожжам- вредителям производства относятся дрожжи родов Pichia, Hansenula, Candida, Rhodotorula, Torula, Torulopsis, Mycoderma, Trichosporon и др. Среди аспорогенных дрожжей встречаются ложные дрожжи, которые образуют псевдомицелий и растут на жидких субстратах в виде пленок. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

На занятии студенты изучают морфологические признаки грибов и дрожжей, их культуральные свойства, знакомятся с представителями отдельных классов. Осваивают методику приготовления препаратов раздавленная капля и технику микроскопирования живых неокрашенных объектов.

Приготовление препаратов типа раздавленная капля

На предметное стекло трубочкой или пипеткой наносят большую каплю воды или этилового спирта.Зажигают спиртовку, прокаливают препаровальную иглу над пламенем горелки и отбирают небольшое количество мицелия из пробирки или чашки Петри, соблюдая правила асептики.Мицелий аккуратно помещают в каплю, нанесенную на предметное стекло и с помощью двух игл расправляют его в воде.Препарат накрывают покровным стеклом и слегка придавливают. Излишки воды удаляют с помощью фильтровальной бумаги. При недостатке жидкости ее добавляют, подпуская пипеткой под покровное стекло.Микроскопируют препарат раздавленная капля сначала с объективом х8, а затем х40 в затемненном поле зрения (конденсор опущен, шторка ирис-диафрагмы прикрыта).При отборе и микроскопии препаратов грибов учитывают следующие рекомендации:а) гриб рода Mucor. Отбирают черновато-серый пушистый воздушный мицелий. При микроскопии обращают внимание на гифы с заполненными спорами спорангиями и колонки, которые образуются при освобождении спорангия;б) гриб рода Aspergillus. Отбирают немного пушистого мицелия с окрашенными конидиями, слегка углубляясь иглой в питательную среду. Обращают внимание на несептированные конидиеносцы;в) гриб рода Penicillium. При отборе стараются взять молодой мицелий (на границе окрашенного и белого мицелия), углубляясь иглой в среду. Обращают внимание на септированные гифы с кисточками.г) гриб рода Alternaria. Берут грибницу в черных участках, углубляясь в нее иглами. Обращают внимание на септированный мицелий, слабо развитые конидиеносцы и крупные конидии, имеющие вид округлых или заостренных многоклеточных образований, напоминающих гранаты-лимонки.Дрожжи.Для лабораторных занятий могут быть использованы пекарские дрожжи. Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помещают в теплую подсахаренную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость. Каплю этой жидкости наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кедрового масла и просматривают препарат с иммерсионной системой. Клетки хорошо видны и при меньших увеличениях.В пекарских дрожжах обычно присутствуют две расы: одна представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании; другая – удлиненно-цилиндрическими, образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий). На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение. Цитоплазма обнаруживается при микроскопировании как более темная зернистая масса, капли жира – светлые, блестящие (сильно преломляют свет), гликоген – в виде плотных зерен.Для установления химической природы внутриклеточных включений применяют микрохимические реакции.Для выявления гликогена к капле дрожжей (хлебных или винных) перед тем как их накрыть покрывным стеклом, добавляют каплю Люголя: гликоген окрашивается в красно-бурый цвет. Если гликогена в клетках нет или мало – дрожжи незрелые или старые.При добавлении к капле дрожжей (круглых) капли 0,5%-ного спиртового раствора краски судан 111можно обнаружить жир (окрасится в красно-желтый цвет).

Оформление и анализ результатов исследованийКратко законспектировать теоретический материал. Промископировать грибы, дрожжи – хлебные, винные, кефирные (с объективом 40х при слабо освещенном поле зрения).Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины исследованных культур грибов и дрожжей с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма. Под каждым рисунком подписать латинское название и увеличение препарата. Измерить клетки хлебных дрожжей, выбрав непочкующиеся клетки.Убедиться в отсутствии подвижности дрожжей (приняв во внимание возможное перемещение клеток с потоком жидкости).Описать культуральные свойства изучаемых грибов.

Контрольные вопросыКак готовят препараты микроскопических грибов и дрожжей?Охарактеризуйте морфологические и культуральные свойства микроскопических грибов.Какие грибы используют в промышленности для получения органических кислот, ферментов, антибиотиков и других ценных продуктов?Охарактеризуйте морфологические свойства дрожжей.Что такое культурные дрожжи? В каких отраслях пищевой промышленности они используются?Обладают ли дрожжи подвижностью?Как производить измерение дрожжей?Как обнаружить в клетках дрожжей гликоген и жир?

freedocs.xyz

5. Морфология дрожжей. Биология дрожжей

10.2 Изучение псевдомицелиальной структуры дрожжей.

Дрожжи родов Candida и Trichosporon наряду с круглыми и овальными клетками могут образовать длинные клетки псевдомицелия.

Препарат «раздавленная капля» не позволяет выявить наличия псевдомицелиальных структур у дрожжей, так как они достаточно хрупкие и быстро разрушаются. Поэтому для этих целей производят посев культур на пластинки с агаровой пленкой. Для этого на стерильное предметное стекло наносят тонкий слой агаризованной питательной среды типа Сабуро и помещают его на подставку на дно стерильной чашки Петри. Затем на тонкой пленке питательной среды делают посев штрихом изучаемой дрожжевой культуры. На штрих стерильным пинцетом помещают стерильное покровное стекло так, чтобы часть штриха осталась свободной. Также на дно чашки Петри опускают стерильный кусочек ваты, смоченный водой, для поддержания необходимой влажности и для предотвращения высыхания засеянной культуры. По истечении 6-7 дней инкубации засеянные предметные стекла микроскопируют в том месте, где расположено покровное стекло. При этом нарушения псевдомицелиалных структур не происходит (при их наличии).

Задание:

1. Подготовить к стерилизации: чашки Петри с подставками, кусочками ваты и предметными стеклами внутри (по 1 чашке на каждого студента), покровные стекла (по 1 на каждого студента), воду в пробирке для смачивания ваты в чашках.

2. Приготовить агаризованную ПС типа Сабуро (глюкоза – 4%, пептон – 1%, агар – 2%) для посева дрожжевых культур на предметные стекла.

3. Произвести посев штрихом дрожжевых культур на предметные стекла.

4. По окончании инкубирования на следующем занятии выявить наличие/отсутствие псевдомицелиальных структур у выросших дрожжей.

10.3 Определение сбраживающей способности дрожжей.

С целью выявления сбраживающей способности дрожжей производят высев исследуемых культур на жидкие питательные среды, содержащие не менее 2% глюкозы, находящиеся в пробирках со вкладышами (маленькие запаянные с одного конца трубочки) или в трубках Дунбара. Наличие сбраживающей способности по окончании 24-ой инкубации при комнатной температуре детектируют визуально по присутствию пузырька газа в запаянном конце трубки Дунбара или во вкладыше.

Задание:

1. Приготовить ПС типа Сабуро-бульон (глюкоза – 4%, пептон – 1%), заполнить ею трубки Дунбара или пробирки со вкладышами. Закрыть ватно-марлевыми пробками, простерилизовать.

2. Произвести посев изучаемых дрожжевых культур на жидкую ПС.

3. Определить наличие/отсутствие сбраживающей способность у изучаемых дрожжевых культур.

10.4 Количественный учёт микроорганизмов с помощью счётных камер.

В счётных камерах Горяева можно произвести подсчёт крупных микробных клеток – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий, спор грибов, некоторых бактерий. Счетная камера представляет собой толстостенное предметное стекло с нанесёнными на нём поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка (рис. 9, а). Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней (рис. 9, б). Эти площадки служат для притирания покровного стекла к средней площадке.

Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов, по-разному сгруппированных.

Сторона квадрата (ABCD, рис. 12, в) равна 1/20 мм, площадь –1/400 мм2, высота – 1/10 мм объём– 1/4000 мм3 или 1/4000000 см3. Большой квадрат ABCD, состоит из 16 малых квадратиков.

Рис. 12. Счётная камера Горяева: а – вид сверху; б – вид сбоку (h – высота камеры),

в – вид при малом увеличении микроскопа.

Каплю взвеси наносят на сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым площадкам камеры до появления ньютоновских колец.

Камеру с исследуемым материалом помещают на предметный столик микроскопа и микроскопируют с объективом 8х и 40х.

Просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах, учитывая все клетки, размещенные внутри квадрата и на пограничных линиях.

Находят среднее количество клеток в одном квадрате. Пересчёт на 1 см3 суспензии с учётом разведения производят по формуле:

N = (a · 1000) · K/(h · S),

где N – число клеток в 1 см3 суспензии; а – среднее число клеток в большом квадрате; h – глубина камеры, мм; S – площадь квадрата, мм2; К - разведение исходной суспензии; 1000 – коэффициент пересчёта мм3 в см3.

Задание:

1. Изучить устройство камеры Горяева, притереть покровное стекло до появления ньютоновских колец.

2. Определить титр дрожжевой суспензии прямым счетом в камере Горяева. Рассчитать количество дрожжей в суспензии.

studfiles.net

Морфология дрожжей

Дрожжи ‑ одноклеточные, неподвижные, не образующие мицелия микроорганизмы, относящиеся к сумчатым плесневым грибам класса Аскомицетес (Ascomycetes). Форма дрожжевых клеток чаще всего овальная, яйцевидная или эллипсовидная. Реже встречаются дрожжи палочковидные и лимонообразные. По своим размерам это довольно крупные микроорганизмы: длина клетки 5-12 мкм, ширина 2-6 мкм. Дрожжевые клетки имеют клеточную оболочку, протоплазматическую мембрану, протоплазму и ясно выраженное ядро. У молодых клеток протоплазма тонкозернистая, по мере старения образуются вакуоли, заполненные клеточным соком. В качестве запасных питательных веществ в протоплазме могут быть включения гликогена, волютина и капельки жира. В некоторых дрожжевых клетках количество жира достигает 30-50% их массы. Такие дрожжи используются в производстве для дрожжевания кормов. Кроме того, дрожжи ‑ хорошие продуценты белка и витаминов, например, комплекса витаминов группы В, витамина Д.

Размножаются дрожжи почкованием, спорообразованием и простым делением.

У спорообразующих видов дрожжей можно наблюдать под микроскопом споры различной формы: округлые, овальные и др. Обычно в клетках содержатся несколько спор (рис. 5).

Классификация дрожжей

Дрожжи и дрожжеподобные грибы относятся к сумчатым, базидиомицетам и несовершенным грибам ‑ Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes.

Рис. 4. Дрожжи:

а-хлебные, б-винные, г-кефирные, д-спорообразующие.

В класс Ascomycetes входит порядок Endomycetales ‑ дрожжеподобные сумчатые грибы, образующие эндоспоры. К этому порядку относятся семейства Saccharomycetaceae ‑ дрожжи, размножающиеся почкованием; Schizosaccnaromycetaceae ‑ дрожжи, размножающиеся делением.

Saccharomicodoceae ‑ лимонновидные дрожжи, размножение которых начинается по типу почкования, а заканчивается по типу деления, К семейству Saccharomycetaceae принадлежит хорошо изученный род Saccharomyces (сахаромицес), к которому относится большинство культурных дрожжей, применяемых в промышленности. Дрожжи этого рода размножаются почкованием и способны к спорообразованию. Отдельные их виды различаются способностью сбраживать те или иные сахара, интенсивностью брожения, количеством образуемого спирта, оптимальными температурами почкования и образования спор и другими признаками. Два вида этого рода наиболее широко применяют в промышленности.

Sacch. сerevisiae ‑дрожжи округлой или овальной формы; используются в производстве этилового спирта, пивоврении, квасоварении и хлебопечении; в различных отраслях применяются свои расы дрожжей; Sacch. ellipsoideus (S. Vini) ‑ дрожжи эллипсоидной формы, применяются преимущественно в виноделии; этот вид также представлен многими расами.

Некоторые другие виды рода Saccharomyces, нередко называемые дикими дрожжами, являются возбудителями порчи многих пищевых продуктов.

Класс Basidiomycetes представлен дрожжами, образующими половые структуры базидиального типа (базидиоспоры). Большая часть этих дрожжей родственна головневым грибам.

К классу Deuteromycetes относятся дрожжеподобные организмы, не образующие эндоспор. Они размножаются почкованием. Интерес представляют роды кандида (Candida), родоторула (Rhodotorula) и торулопсис (Torulopsis). Представители их широко распространены в природе, они аэробы, многие вызывают порчу различных продуктов: вин, пива, пекарских дрожжей, квашеных овощей, безалкогольных напитков и многих других продуктов.

Имеются виды дрожжей рода Candida, вызывающие заболевания (кандидозы) у людей, при этом поражаются слизистые рта и других органов. Есть и полезные виды рода Candida, они широко применяются в микробиологической промышленности: используются при получении белково-витаминного препарата, органических кислот, многоатомных спиртов; представители этого рода принимают участие в очистке сточных вод, являясь компонентами активного ила, участвуют в очистке почвы и морской воды от нефтяных загрязнений. Дрожжи р. Candida размножаются многосторонним почкованием, большинство видов образуют псевдомицелий. Псевдомицелий часто бывает дифференцирован на псевдогифы и бластоспоры. Бластоспорами у дрожжей называют вегетативные споры, образующиеся путем почкования на псевдомицелии. Они обычно круглой или овальной формы и располагаются по отношению к псевдомицелиальным клеткам в определенном порядке, образуя или цепочки, или мутовки.

К несовершенным грибам относятся также широко распространенные в природе виды дрожжей р. Rhodotorula, отличающиеся желтой или красной окраской за счет содержания каротиноидов. Их применяют для обогащения полученной биомассы провитамином А.

Дрожжи рода Torulopsis имеют круглую или овальную форму. Многие вызывают лишь слабое спиртовое брожение. Отдельные виды используют в производстве кумыса и кефира. Виды кандида используются в производстве кормовых дрожжей для нужд животноводства и птицеводства.

Определение размеров микробной клетки

Величину микроорганизмов измеряют под микроскопом, пользуясь окулярной линейкой (микрометром). Микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в центре которой выгравирована шкала с делениями (50 или 100). Окуляр-микрометр помещают в окуляр делениями вниз, предварительно отвинтив глазную линзу. После завинчивания линзы окуляр вставляют в монокулярную насадку микроскопа.

Работа начинается с определения цены деления окуляра микрометра при данном увеличении микроскопа. Для этой цели служит дополнительное приспособление ‑ объект-микрометр, который представляет собой стеклянную пластинку (иногда в металлической оправе) с линейкой в центре. Эта линейка имеет длину 1 мм и разделена на 100 делений, каждое из которых равно 0,01 мм (10 мкм). Объект-микрометр помещают на предметный столик и фокусируют с тем объективом, при котором будут определять размеры клеток. Вращая окуляр и перемещая объект-микрометр, совмещают нулевую черту окуляра-микрометра с любой чертой объекта-микрометра, после чего находят следующее совмещение (рис. 5). Вычисляют, скольким делениям объекта-микрометра соответствует одно деление окулярного микрометра. Предположим, два деления объекта-микрометра (20 мкм) соответствуют пяти делениям окуляра-микрометра, следовательно, величина (цена) деления окуляра-микрометра равна 4 мкм (20:5). Зная величину деления окуляра-микрометра, приступают к определению величины микроорганизмов при том же увеличении. С этой целью измеряют, какому числу делений окуляра-микрометра соответствуют длина и ширина клетки, и умножают полученные числа на цену деления окуляра. Для достоверности результата необходимо измерить не менее 20 клеток и получить средние размеры.

Рис. 5. Определение цены деления окуляра-микрометра

Самостоятельная работа

1. Изучение морфологии клеток винных, пекарских и диких дрожжей в препарате "раздавленная капля". Определение относительного количества живых и мертвых клеток в пекарских дрожжах.

2. Изучение содержания включений в дрожжевой клетке:

а) изучение содержания гликогена;

б) обнаружение жира;

в) обнаружение волютина.

3. Определение размера дрожжевой клетки одной из культур.

4. Оформление протокола исследования.

Методические указания

РАЗДЕЛ 1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ДРОЖЖЕЙ

Для микроскопирования дрожжей следует приготовить препарат "раздавленная капля" из чистых культур дрожжей ‑ винных, пекарских и диких. Приготовленные препараты изучить под микроскопом со средним увеличением (с объективом х40). При этом необходимо рассмотреть, прежде всего, форму клетки и ее строение, обратить внимание на клеточную оболочку, цитоплазму, вакуоли и включения запасных питательных веществ. Цитоплазма при микроскопировании представляет собой темную зернистую массу, вакуоли и капли жира в виде светлых (блестящих) пятнышек, гликоген ‑ в виде уплотненных зерен. Необходимо убедиться в неподвижности дрожжевых клеток.

Затем изучают способы бесполого размножения дрожжей. Для этого нужно отыскать в поле зрения микроскопа почкующиеся клетки. Все препараты зарисовать при работе с объективом х40. На рисунках обозначить анатомическое строение дрожжевых клеток, почкующиеся клетки. В выводе указать отличие изученных препаратов дрожжей по форме.

Определить относительное количество живых и мертвых клеток в пекарских дрожжах ‑ старых и подмоложенных. К капле суспензии дрожжей на предметном стекле добавить каплю слабого раствора (1:1000) метиленового синего, размешать, накрыть покровным стеклом. Мертвые клетки прокрашиваются быстрее и ярче вследствие посмертного повышения проницаемости клеточной оболочки. Препарат зарисовать в цвете.

РАЗДЕЛ 2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВКЛЮЧЕНИЙ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ

В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в цитоплазме клеток могут формироваться морфологические образования, представляющие собой либо продукты обмена клетки, либо запасные питательные вещества. Включения различны по своей химической природе. Это могут быть жироподобные вещества, полисахариды (гликоген, крахмал, гранулеза), серополифосфаты (волютин), кристаллы щавелевой кислоты и др. Они не являются постоянными компонентами клетки, они образуются в зависимости от условий культивирования, возраста культуры и могут использоваться в метаболизме клетки.

Клеточные включения могут выявляться цитохимическими методами.

а). Определение полисахаридов (гликогена и гранулезы)

1. На предметное стекло наносят небольшую каплю микробной суспензии, добавляют каплю концентрированного раствора Люголя и выдерживают 10-15 минут при комнатной температуре.

2. Накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости и микроскопируют с сухой системой либо с иммерсией.

Гранулы крахмалоподобных веществ (гранулеза) окрашены в синий, а гранулы гликогеноподобных веществ (крахмал) ‑в красновато-коричневый цвет.

Окрашивание гликогена происходит в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорганизмы, подкисляют либо на предметное стекло вместо воды наносят каплю 0,5%-го раствора HCl и в ней эмульгируют исследуемую культуру.

б). Обнаружение жироподобных веществ

Жировые включения или липидные гранулы в клетках микроорганизмов могут быть представлены нейтральными жирами и поли-β-оксимасляной кислотой. Коэффициент преломления жиров и гранул, состоящих из нейтральных жиров, отличается от коэффициента преломления протоплазмы, поэтому в препарате "раздавленная капля" жир виден в клетках в виде блестящих ярких капелек. Препарат необходимо рассматривать в затемненном поле зрения, опустив конденсор и закрыв диафрагму (объектив х40). Гранулы поли-β-оксимасляной кислоты выявляют с помощью жирорастворимого красителя судана III.

1. Наносят каплю густой микробной взвеси на предметное стекло. Добавляют каплю формалина (40%-го), либо 5%-го раствора HCl и выдерживают 5 минут (формалин убивает клетку и разрыхляет ее оболочку).

2. Добавляют каплю метиленового синего (1:10 либо 1:40) и выдерживают 10 минут.

3. Добавляют каплю концентрированного раствора судана (III) в 90% этаноле и выдерживают 5 минут. Накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с сухой или иммерсионной системой.

Клетки окрашены в синий, включения жира - в розово-оранжевый цвет.

в). Выявление волютина

Волютин-полиметафосфат, в клетках чаще содержится в виде зерен диаметром 0,3 мкм, иногда в дисперсном состоянии. Волютин встречается в клетках многих бактерий и большинства дрожжей. Волютин дает явление метахромазии; на этом основана его окраска метиленовым синим. Волютин растворяется в слабых кислотах и щелочах, но после окраски становится кислотоустойчивым, на этом основан метод Омелянского.

Окраска метиленовым синим: фиксированный мазок дрожжей окрашивают метиленовым синим 3-5 мин, промывают, сушат и микроскопируют в иммерсионной системе. Зерна волютина выглядят красно-фиолетовыми на фоне голубой протоплазмы.

Метод Омелянского: фиксированный мазок окрашивают в течение 30 с фуксином Циля, затем обесцвечивают 1% раствором серной кислоты 30 мин. и после промывания водой докрашивают метиленовым синим 1 мин.; промывают водой, высушивают и микроскопируют в иммерсионной системе. Зерна волютина ‑ ярко-красные, протоплазма ‑ голубая. Препараты зарисовать в цвете.

РАЗДЕЛ 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКИ

Измерить непочкующиеся клетки по длине и в поперечнике, пользуясь окуляр- и обьект-микрометром (см. методику исследования на с. )

В протоколе исследования по данной работе привести классификацию дрожжей, зарисовать микроскопическую картину изучения морфологии дрожжей, включений в дрожжевую клетку, привести размеры дрожжевой клетки. Сделать вывод по работе.

pdnr.ru